Чем обусловлена реакция высаливания

Чем обусловлена реакция высаливания

Реакции осаждения белков

4. Реакции осаждения белков

Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора.

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

1) неразведенный яичный белок;

2) насыщенный раствор сульфата аммония;

5) дистиллированная вода;

6) сульфат аммония в порошке.

Необратимое осаждение белков.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

Осаждение при кипячении.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы;

Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом раствор мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю раствора NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается.

Осаждение концентрированными минеральными кислотами.

Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислоты выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота.

1) яичный белок,1% раствор;

2) концентрированная серная кислота;

3) концентрированная хлористоводородная кислота;

4) концентрированная азотная кислота.

Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной кислот. затем, наклонив пробирку под углом 45 градусов, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит.

Осаждение органическими кислотами.

Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой кислотой пользуются при определении белка в моче.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор;

3) сульфосалициловая кислота, 10% раствор.

Осаждение белка солями тяжелых металлов.

Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) сульфат меди, 10% раствор;

3) ацетат свинца, 5% раствор;

4) нитрат серебра, 5% раствор.

Источник

Как удалить белки из раствора?

Денатурация

Денатурация – необратимое осаждение белка из-за разрыва связей, стабилизирующих четвертичную, третичную, вторичную структуры белка, сопровождаемое изменением растворимости, вязкости, химической активности, снижением или полной потерей биологической функции.

1. Физическая денатурация

Вызывается повышением температуры, ультрафиолетовым и микроволновым излучением, механическими воздействиями, ионизацией заряженными частицами.

2. Химическая денатурация

Зависит от природы денатурирующего реагента:

На эффекте химической денатурации основаны устаревшие, но простые и наглядные тимоловая проба и проба Вельтмана, используемые ранее в клиникo-лабораторной диагностике для оценки состава белков крови.

Высаливание

Соли в низких концентрациях способны взаимодействовать с ионными группами белков, отвечающих за внутримолекулярные взаимодействия, приводить к их раскрытию и повышать растворимость.

Так как белки плазмы крови отличаются по размерам, заряду, строению, то можно подобрать такие количества соли, которые вызовут осаждение менее устойчивых белков, пока другие еще будут растворены.

Например, раньше в диагностических целях так определяли соотношение белковых фракций альбумины/глобулины в плазме крови. Альбумины, как более полярные молекулы, остаются в растворенном состоянии при 50% насыщении раствора нейтральными солями, в то время как глобулины в этих условиях уже осаждаются. В норме соотношение альбумины/глобулины в плазме крови равно 1,2-1,8.

Осаждение водоотнимающими средствами

При добавлении водоотнимающих средств (ацетон, этанол) происходит отнятие у белка гидратной оболочки, но не заряда. Растворимость несколько снижается, но денатурации не наступает. Например, в этом заключается антисептическое действие этанола.

Изменение рН

Мягкое изменение рН до изоэлектрической точки белка ведет к исчезновению заряда, одновременному уменьшению гидратной оболочки и, как следствие, снижению растворимости молекулы.

Источник

Лабораторная работа 3. Реакции осаждения белка

Опыт 1. Осаждение белков при кипячении

Почти все белки свертываются при нагревании в нейтральной или слабокислой среде. В сильнокислых и щелочных средах растворы белков при кипячении не коагулируют и могут дать осадок лишь при добавлении нейтральной соли (NaCl и др.). Устойчивость белка в растворе зависит от приобретения положительного заряда в сильнокислой среде и увеличения отрицательного заряда в щелочной среде.

При понижении рН диссоциация карбоксильной группы подавляется и молекула становится положительно заряженной. При повышении рН происходит отрыв протона аминогруппы и молекула приобретает отрицательный заряд. Наиболее полное и быстрое осаждение белков происходит в изоэлектрической точке (это такое значение рН, при котором частицы белка не передвигаются в электрическом поле ни к аноду, ни к катоду). Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (рН

Порядок выполнения опыта. В 5 пробирок наливают по 5 капель 1%-ного раствора яичного белка. Первую пробирку нагревают до кипения, при этом жидкость мутнеет. Во второй пробирке раствор белка нагревают до кипения и прибавляют 1 каплю1%-ного раствора уксусной кислоты. При стоянии выпадает хлопьевидный осадок белка, т.к. частицы белка теряют заряд и приближаются к изоэлектрическому состоянию. В третью пробирку добавляют 5 капель 1%-ного раствора уксусной кислоты для получения сильнокислой реакции среды. При кипячении осадок не образуется, поскольку белковые мицеллы перезаряжаются и несут положительный заряд, повышая их устойчивость. В четвертую пробирку приливают 5 капель 1%-ного раствора уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора хлористого натрия и нагревают, выпадает белый хлопьевидный осадок белка, т.к. его частицы теряют заряд вследствие взаимодействия белка с ионами хлористого натрия. В пятую пробирку добавляют 2 капли 10%-ного раствора едкого натра. При кипячении жидкости осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка увеличивается.

Указания к составлению отчета:Необходимо отметить положительный результат осаждения плюсом, а отрицательный – минусом и сделать выводы по работе касающихся изоэлектрической точки.

Опыт 2. Высаливание

Высаливанием называют осаждение белков с помощью больших концентраций нейтральных солей: NaCl, (NH₄)₂SO₄ и др. Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка и одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуется неодинаковая концентрация одних и тех же солей. Хлористый натрий осаждает слабее, чем сернокислый аммоний, вследствие меньшей дегидратирующей способности. При высаливании белок обычно не теряет своих естественных свойств, например, он может вновь проявлять ферментативную активность. Метод высаливания позволяет разделить белки на различные белковые фракции: альбумины, глобулины и др.

Порядок выполнения опыта. 1). В пробирку наливают 20 капель раствора белка и прибавляют порошок хлористого натрия до полного насыщения раствора. Через несколько минут появляется осадок глобулинов. Содержимое пробирки отфильтровывают, в фильтрате остается альбумин, который в нейтральных растворах не выпадает даже при добавлении хлористого натрия. К фильтрату прибавляют по каплям 1%-ный раствор уксусной кислоты (15-20 капель), альбумин выпадает в осадок, его отфильтровывают и проверяют фильтрат на отсутствие белка при помощи биуретовой реакции;

2) К 15 каплям раствора белка добавляют 15 капель насыщенного раствора сернокислого аммония и перемешивают, выпадает осадок глобулинов. Его отфильтровывают, в фильтрате остается альбумин, к нему добавляют порошок сернокислого аммония до полного насыщения. Выпадает осадок яичного альбумина, его отфильтровывают, фильтрат проверяют на отсутствие белка с помощью биуретовой реакции.

Указания к составлению отчета:необходимо отметить положительный результат осаждения белков плюсом, а отрицательный – минусом; Результаты занести в таблицу и сделать выводы о высаливающей способности указанных растворов.

Опыт 3. Осаждение белков солями тяжелых металлов

Осаждение белков солями тяжелых металлов в отличие от высаливания, происходит при небольших концентрациях солей. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е. денатурацию. Способность белка прочно связывать ионы тяжелого металла в виде нерастворимых осадков используется как противоядие при отравлении солями ртути, меди, свинца и др.

Порядок выполнения опыта. 1.Осаждение медным купоросом. К 5 каплям раствора яичного белка прибавляют 1 каплю 10%-ного раствора сернокислой меди, образуется бледно-голубой осадок, нерастворимый в воде. В другой пробирке к такой же порции белка приливают 1 каплю 10%-ного раствора сернокислой меди, а затем еще 10 капель и наблюдают растворение осадка в избытке реактива.

2. Осаждение белков уксуснокислым свинцом. К 5 каплям раствора белка приливают 2 капли 5%-ного раствора уксуснокислого свинца. Образуется нерастворимый в воде осадок, но легко растворяющийся в избытке осадителя.

Указания к составлению отчета: результаты реакций записывают в таблицу. Появление осадка обозначают плюсом, растворение осадка – минусом и делают обоснованные выводы по работе.

Опыт 4. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка. В избытке минеральных кислот (за исключением азотной) выпавший осадок белка растворяется.

Порядок выполнения опыта: а) осаждение азотной кислотой. К 5 каплям концентрированной азотной кислоты приливают по стенке пробирки равный объем раствора белка. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца;

б) осаждение серной кислотой проводят аналогично. При избытке кислоты образующийся осадок растворяется.

Опыт 5. Осаждение белков органическими кислотами

Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков. Наибольшее применение получили трихлоруксусная CCl₃COOH и сульфосалициловая C₆H₃(OH)(COOH)SO₃H.

Порядок выполнения опыта: а) осаждение сульфосалициловой кислотой. К 5 каплям раствора белка добавляют 2 капли 20%-ного раствора сульфосалициловой кислоты. Выпадает осадок белка;

б) осаждение трихлоруксусной кислотой проводят аналогично.

Опыт 6. Осаждение белков органическими растворителями

В органических растворителях (спирт, ацетон) белки не растворяются. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. При осаждении спиртом раствор белка должен быть нейтральным или слабокислым, но не щелочным. Успешнее реакция проходит в присутствии хлористого натрия вследствие снятия заряда с частиц белка. При кратковременном действии и на холоду реакция осаждения белка спиртом обратима. При длительном воздействии происходит денатурация белка.

Порядок выполнения опыта. К 5 каплям раствора белка приливают 15-20 капель этилового спирта (или ацетона), раствор мутнеет. Добавляют 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия, при стоянии выпадает осадок белка.

Источник

Высаливание белков. Высаливающие агенты. Механизм высаливания. Практическое использования высаливания.

Механизм высаливания связан с тем, что добавляемые катионы и анионы снимают гидратную оболочку и одновременно, возможно, нейтрализуют заряд белка (состояние близкое к изоэлектрической точке). При таком осаждении сохраняются нативные свойства белков (биологическая активность) и сохраняются все уровни структурной организации белковой молекулы.

Если затем к осадку белка добавить воду, удалить диализом соль, то белок снова перейдет в раствор и будет проявлять биологическую активность. Высаливание используют для разделения белков сыворотки крови, молока, яичного белка на две фракции: альбумины и глобулины.

Глобулины, как менее растворимые белки и с большей молекулярной массой осаждаются первыми, при 50%-ном насыщении раствора белка (NH4)2SO4 или Na2SO4, а альбумины при 100%-ном.

Денатурация белков. Факторы, механизм, практическое использование денатурации белков.

Для обозначения процесса, при котором нативные свойства белка теряются, используют термин ДЕНАТУРАЦИЯ. Это лишение белка его природных, нативных свойств, сопровождающееся разрушением четвертичной, третичной, а иногда и вторичной структуры белковой молекулы, которое возникает при разрушении дисульфидных и слабых типов связей, участвующих в образовании этих структур. Первичная структура при этом сохраняется, потому что она сформирована прочными ковалентными связями. Разрушение первичной структуры может произойти только в результате гидролиза белковой молекулы длительным кипячением в растворе кислоты или щелочи.

Факторы, вызывающие денатурацию белков

1. Высокие температуры. Для разных белков характерна различная чувствительность к тепловому воздействию. Часть белков подвергается денатурации уже при 40-500С. Такие белки называют термолабильными. Другие белки денатурируют при гораздо более высоких температурах, они являются термостабильными.

2. Ультрафиолетовое облучение

3. Рентгеновское и радиоактивное облучение

5. Механическое воздействие (например, вибрация).

1. Концентрированные кислоты и щелочи. Например, трихлоруксусная кислота (органическая), азотная кислота (неорганическая).

2. Соли тяжелых металлов (например, CuSO4).

3. Органические растворители (этиловый спирт, ацетон)

4. Растительные алкалоиды.

5. Мочевина в высоких концентрациях

Воздействие факторами денатурации применяют для стерилизации оборудования и инструментов, а также как антисептики.

Дата добавления: 2019-11-16 ; просмотров: 2333 ; Мы поможем в написании вашей работы!

Источник

Чем обусловлена реакция высаливания

При определенных условиях в растворах ВМС, так же как и у золей, можно наблюдать укрупнение частиц, т. е. процесс коагуляции. Однако в отличие от золей период скрытой коагуляции растворов ВМС весьма продолжителен, иногда даже вовсе не переходящий в явную форму. Явная коагуляция раствора ВМС может протекать в форме высаливания или застудневания.

Высаливание наступает вследствие нарушения сольватной связи между макромолекулами ВМС и растворителем, т. е. вследствие десольватации частиц. Это приводит к постепенному понижению растворимости ВМС и в конечном итоге к выпадению его в осадок. Высаливающее действие электролита проявляется тем сильнее, чем больше степень сольватации его ионов, т. е. чем выше его способность десольватировать макромолекулы ВМС. Коагуляцию растворов ВМС вызывают оба иона прибавленного электролита. Высаливающим действием обладают не только соли, но также все вещества, способные взаимодействовать с растворителем и понижать растворимость ВМС. Например, хорошо высаливают желатину из водных растворов ацетон и спирт, так как они легко связываются с водой и тем самым дегидратируют частицы желатины.

По высаливающему действию ионы электролитов располагаются в лиотропные ряды:
ряд анионов:

Li + > Na + > К + > Rb + > Cs + > Mg 2+ > Ca 2+ > Sr 2+ > Ba 2+

Высаливающее действие ионов в приведенных рядах усиливается справа налево. Часто осаждение полимера проводят, приливая к раствору жидкость, в которой он менее растворяется («осадитель» или «нерастворитель»). Чем ниже растворимость ВМС в данном растворителе, тем быстрее и полнее происходит высаливание. У одного и того же полимера растворимость зависит от длины макромолекул. Чем больше их длина и молекулярная масса, тем меньше растворимость и легче происходит высаливание частиц. Это свойство используют при анализе полидисперсных систем. Постепенно прибавляя к раствору возрастающие количества осадителя, можно выделить из раствора отдельные фракции частиц. Высаливание применяют во многих технологических процессах (в мыловарении, при выделении красок и канифоли, в производстве искусственных волокон).

Студни (гели) могут образовывать также коллоидные частицы таких веществ, как Si0₂, TiO₂, Sn0₂, V₂0₅ и др.

В зависимости от природы веществ, образующих студни, различают хрупкие гели и эластичные гели (студни). Хрупкие гели построены из жестких частиц. Типичным представителем является гель кремниевой кислоты. При высушивании хрупкие гели почти не изменяют свой объем, но приобретают большую хрупкость и пористость.

Электролиты влияют на процесс застудневания. По своему действию анионы можно расположить в ряд застудневания, аналогичный ряду высаливания. На скорость застудневания белков (как и на процесс высаливания их) влияет рН среды. Наибольшую скорость эти процессы имеют в изоэлектрической точке (при дзета = 0).

Благодаря большому содержанию жидкости в структуре студней в них возможны процессы диффузии и протекание химических реакций. Так, например, в водных студнях, содержащих 95-99% воды от их массы, диффузия происходит почти с такой же скоростью, как и в чистой воде. Это свойство используют в электрохимии для приготовления удобных в работе электролитических мостиков из студня агар-агара с добавкой КСl. Однако диффузия в студнях все же отличается от диффузии в жидкостях, так как в студнях отсутствует перемешивание и невозможно образование конвекционных потоков, которые почти всегда имеют место в жидких растворах. Это обусловливает своеобразность протекания химических реакций в студнях. Так, в разных участках студня различные реакции могут протекать независимо одна от другой. Если один из продуктов реакции является твердым труднорастворимым веществом, то в студне наблюдается периодическое осаждение этого вещества (кольца Лизеганга) вместо образования осадка по всему объему.

Студни и студнеобразование играют большую роль в жизни животных и растений. Студнями являются мясо, творог, простокваша, мармелад, кисель и многие другие пищевые продукты. Студнеобразование и студни находят широкое применение в производстве товаров народного потребления, например в производстве вискозного, ацетатного шелка, искусственной кожи, резиновых изделий, столярного клея и др.

Обладая большой устойчивостью по отношению к действию электролитов, растворы ВМС, будучи прибавлены в определенном количестве к золям, значительно повышают их агрегативную устойчивость. Это явление получило название защитного действия или защиты. Так, например, добавка к красному золю золота небольшого количества желатины во много раз повышает устойчивость его против коагулирующего действия электролитов (сильно возрастает порог коагуляции). Защищенный золь может существовать в растворе в больших концентрациях, чем незащищенный. В некоторых случаях защищенные золи даже становятся обратимыми. Примером может служить медицинский препарат протаргол (защищенный золь серебра). После удаления растворителя он превращается в сухой коллоидный порошок, растворимый затем в любых количествах воды.

Защитное действие растворов ВМС зависит от природы вещества и природы защищаемого им золя. Количественно оно характеризуется так называемым золотым числом, которое выражается минимальным числом миллиграммов сухого ВМС, которое предохраняет 10 см 3 красного гидрозоля золота от перемены окраски при добавлении к нему 1 см 3 10%-ного раствора хлорида натрия. Защитное действие различных ВМС весьма различно. Особенно высоким защитным действием обладают белки. Явление защиты играет важную роль в ряде физиологических процессов. Так, например, защитные вещества белкового характера удерживают в мелкодисперсном состоянии находящиеся в крови труднорастворимые фосфат и карбонат кальция. При некоторых заболеваниях содержание защитных веществ в крови понижается, что приводит к выпадению указанных солей в осадок (образование камней в почках, печени, отложение солей на суставах). Многие лекарственные вещества являются защищенными золями (колларгол, протаргол и др.). О применении ВМС для стабилизации суспензий. В фотографии используют светочувствительные коллоидные препараты бромида серебра, защищенные желатиной. Широко применяется желатина как защитное вещество в пищевой промышленности.

Источник