Что значит условный нормоценоз фемофлор 16

Фемофлор

Фемофлор — это скрининговое исследование микрофлоры урогенитального тракта у женщин методом ПЦР (в режиме Real-time реального времени).

Фемофлор назначают при:

Вагинальная микрофлора

Причины и факторы нарушения вагинального биоценоза

Показания и противопоказания к применению метода

Способ позволяет в короткие сроки объективно:

С помощью данного метода определяются следующие показатели:

Варианты комплектации «ФЕМОФЛОР»

Правила подготовки к исследованию «ФЕМОФЛОР»

Забор урогенитального материала у детей до 18 лет, беременных, девственниц осуществляет врач гинеколог (приносной материал).

Источник

Исследование биоценоза урогенитального тракта Фемофлор-16 (определение ДНК) (16 показателей + КВМ)

Что такое Фемофлор?

Дисбаланс микробиоты урогенитального тракта женщин, обусловленный условно-патогенными микроорганизмами, характеризуется изменением качественного и/или количественного состава нормобиоты, метаболическими и иммунными нарушениями, в ряде случаев клиническими проявлениями. Частным проявлением выраженного дисбаланса биоты является бактериальный вагиноз.

Полное выявление этиологической структуры заболевания позволит своевременно установить диагноз, выявить осложненные формы течения заболевания и, соответственно, провести направленную адекватную терапию, в том числе на ранней стадии, до развития осложнений.

В основу метода положена комплексная количественная оценка биоты методом ПЦР в «реальном времени» (РВ). Проводят сравнение количества конкретных представителей нормо – и условно-патогенной биоты с общим количеством микроорганизмов с целью выявления дисбаланса биоты, степени его выраженности и определения этиологической роли конкретных микроорганизмов в его развитии при условии контроля качества получения клинического образца для исследования.

Способ позволяет в короткие сроки объективно оценить:

Показатели, анализируемые с помощью набора Фемофлор 16:

Контроль взятия материала (КВМ).

Необходимым условием количественного анализа урогенитальной биоты является правильная техника взятия соскоба с поверхности соответствующего биотопа (уретра, цервикальный канал, влагалище). Показателем правильного взятия биоматериала является достаточное количество геномной ДНК человека в пробе. Источником этой ДНК являются эпителиальные клетки, попадающие в пробу при правильной технике взятия биоматериала. Оптимальная величина этого показателя должна составлять не менее 105.

Показатель оценивается в абсолютных значениях.

Общая бактериальная масса (ОБМ).

Показатель, по которому можно судить об общем количестве бактерий. Оценивается в абсолютных значениях. Обычно эта величина составляет 106 – 108. Величина ОБМ большая, чем 108, свидетельствует об избыточном микробном обсеменении биоматериала. Чем больше величина ОБМ, тем больше величина микробной массы в образце. Величина показателя ОБМ меньшая, чем 105 соответствует сниженному количеству микроорганизмов в образце, что может быть следствием атрофических процессов или антибиотикотерапии.

Оценка нормобиоты.

Главным представителем нормофлоры урогенитального тракта у женщин репродуктивного возраста являются представители рода Lactobacillus (ЛБ).

Оценка нормобиоты производится как в абсолютных значениях, так и относительно общей бактериальной массы. В норме абсолютное количество лактобацилл практически не отличается от общего количества бактерий, то есть составляет 106–108

Относительное количество лактобацилл – разница между Lg10 общей бактериальной массы (ОБМ) и Lg10 лактобацилл (ЛБ). Например, если общее количество бактерий составляет 107, Lg10 этого количества будет равен 7. В норме разница логарифмов (порядков) ОБМ и ЛБ не должна превышать 0,5, что определяется погрешностью метода.

Умеренно сниженный уровень лактобацилл – при разнице логарифмов (порядков) от 0,5 до 1.

Значительно сниженный уровень лактобацилл–при разнице логарифмов (порядков) больше чем 1.

Чем меньшую долю в ОБМ составляют лактобациллы, тем сильнее угнетена нормальная флора.

Оценка аэробной и анаэробной условно-патогенной микрофлоры.

Количественный уровень аэробной и анаэробной условно-патогенной микрофлоры можно оценить как в абсолютных, так и относительных значениях. Абсолютные количества соответствуют показателям при бактериологичесих исследованиях. Например, количество микроорганизма Gardnerella vaginalis составляет 103.

Относительное количество того или иного микроорганизма вычисляется по отношению к количеству Lactobacillus spp., по разнице между Lg10 лактобацилл и Lg10 конкретного микроорганизма аналогично тому, как вычисляется относительное количество самих лактобацилл по отношению к общему количеству бактерий (ОБМ).

В урогенитальном тракте женщин репродуктивного возраста как аэробные, так и анаэробные условно-патогенные микроорганизмы могут быть причиной патологических процессов в урогенитальном тракте.

Оценка микоплазм, уреаплазм и грибов рода Candida.

Показания к назначению анализа

Материал для исследования

Для исследования используют соскобы эпителиальных клеток

Критерии количественной оценки биоты

Абсолютный показатель является ориентировочным, зависит от техники взятия биоматериала и способа выделения ДНК.

Нормоценоз

Состояние нормоценоза характеризуется следующими показателями:

Умеренный дисбиоз

Выраженный дисбиоз.

Состояние выраженного дисбиоза характеризуется следующими показателями:

Этиологическая структура выявленного дисбаланса:

Анаэробный, если дисбаланс вызван анаэробными микроорганизмами: Gardnerella vaginalis /Prevotella bivia/Porphyromonas spp; Atopobium vaginae; Eubacterium spp; Sneathia spp /Leptotrihia spp/Fusobacterium spp; Megasphera spp/Veilonella spp/Dialister spp; Lachnobacterium spp/Clostridium spp; Mobiluncus spp/Corynebacterium spp; Peptostreptococcus spp

Аэробный, если дисбаланс, вызван аэробной микрофлорой: Enterobacteraceae, Streptococcus spp и Staphylococcus spp

Смешанный если дисбаланс, вызван любым сочетанием аэробной, анаэробной флоры и грибами рода Candida.

Инфекционный процесс, вызванный грибами рода Candida, может протекать без дисбиотических нарушений со стороны условно-патогенной флоры, а также может сочетаться с дисбиозом.

Источник

Что значит условный нормоценоз фемофлор 16

Фемофлор 16 – расширенное молекулярно-биологическое исследование качественного и количественного состава микрофлоры мочеполовых путей у женщин, включающее оценку общей бактериальной массы, состояния нормофлоры, определение широкого спектра клинически значимых условно-патогенных микроорганизмов, в том числе микоплазм и уреаплазм, а также грибов рода Candida.

Исследование информативно только для женщин репродуктивного возраста.

Исследование биоценоза влагалища методом ПЦР.

Femoflor 16 Real Time PCR.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

По данным проекта Human Microbiom Project Национального института здоровья США, установлено, что в организме человека обитает около 10 000 видов микроорганизмов, преимущественными локусами распространения которых являются кожа, кишечник и урогенитальный тракт. Микрофлора мочеполовых путей у женщин в норме представлена преимущественно различными видами бактерий рода Lactobacillus, которые играют большую роль в предотвращении колонизации урогенитального тракта болезнетворными микроорганизмами. Вследствие различных причин может возникать дисбаланс микробиоты мочеполового тракта, выражающийся в нарушении её количественных и качественных характеристик, что в итоге приводит к развитию воспалительного процесса. Рядом исследований показано, что в этиологической структуре мочеполовых инфекций, обусловленных дисбалансом условно-патогенной флоры, в большинстве случаев играет роль ассоциация микроорганизмов и изменения в составе нормофлоры. Клинически такие состояния очень часто характеризуются нечеткой выраженностью симптомов, отсутствием специфических признаков и склонностью к хроническому течению, что обуславливает высокий риск присоединения инфекций, вызванных патогенными микроорганизмами, а также развития осложнений со стороны репродуктивной системы. Это определяет первостепенную роль своевременной и качественной диагностики урогенитальных инфекций, ассоциированных с условно-патогенной микрофлорой. Традиционные лабораторные исследования, проводимые для обнаружения болезнетворных микроорганизмов, которые позволяют определить факт наличия возбудителя, малоинформативны в диагностике заболеваний, вызванных условно-патогенной флорой, так как обнаружение её представителей само по себе не свидетельствует о заболевании. Также необходимо отметить, что условно-патогенная микрофлора, наиболее часто являющаяся причиной воспалительных заболеваний мочеполовых путей у женщин, представлена преимущественно анаэробными микроорганизмами (живущими в условиях отсутствия кислорода). Культивирование таких бактерий является технически очень сложным процессом, требующим специального оборудования, и в настоящее время в большинстве лечебных учреждений затруднено.

Проблему качественной диагностики урогенитальных инфекций, вызванных условно-патогенной флорой, позволило решить внедрение в практику метода полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени. Методика исследования основана на обнаружении в исследуемом материале генетического материала (ДНК) микроорганизма, его многочисленном копировании и идентификации. Так как количество полученных в конце реакции копий зависит от исходного количества исследуемой ДНК, анализ позволяет определить содержание микроорганизма в биоматериале. Отечественная разработка Фемофлор, основанная на технологии RT-ПЦР, предназначена для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин и позволяет выявлять ДНК условно-патогенных микроорганизмов, ДНК лактобактерий и геномной ДНК человека (в качестве контрольного параметра). Спектр выявляемых показателей позволяет получить комплексное представление о качественных и количественных изменениях состава микрофлоры урогенитального тракта, что во многом определяет адекватную тактику медикаментозной терапии. Разработано несколько вариантов комплектации тестовых систем Фемофлор, в зависимости от спектра выявляемых условно-патогенных микроорганизмов. Фемофлор 16 позволяет определять 25 показателей, включая контроль взятия материала, общую бактериальную массу и 23 группы микроорганизмов:

Lactobacillus spp. – в большинстве случаев составляют основу нормальной микрофлоры влагалища у женщин репродуктивного возраста;

Семейство Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. – являются компонентами нормальной флоры урогенитального тракта у женщин, могут быть причиной вагинита;

Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia, Porphyromonas spp. – представители нормальной и транзиторной (Gardnerella vaginalis) флоры, этиологические агенты развития бактериального вагиноза;

Eubacterium spp. – бактерии этого семейства преимущественно обитают в кишечнике, условно патогенны, могут вызывать развитие бактериального вагиноза;

Sneathia spp., Leptotrihia spp., Fusobacterium spp. – анаэробные микроорганизмы, с ними может быть ассоциировано развитие бактериального вагиноза;

Veilonella spp., Megasphaera spp., Dialister spp. – условно-патогенные анаэробные бактерии, участвуют в развитии бактериального вагиноза;

Lachnobacterium spp. – анаэробные труднокультивируемые бактерии, ассоциированы с развитием бактериального вагиноза;

Clostridium spp. – представитель нормальной флоры кишечника, в урогенитальном тракте условно-патогенный микроорганизм, может вызывать бактериальный вагиноз;

Mobiluncus spp., Corynebacterium spp. – анаэробные условно-патогенные микроорганизмы, могут вызывать инфекции урогенитального тракта;

Peptostreptococcus spp. – анаэробные кокки (шаровидные бактерии), условно-патогенны, могут вызывать бактериальный вагиноз;

Atopobium vaginae – анаэробный микроорганизм, может приводить к бактериальному вагинозу;

Mycoplasma hominis, Ureaplasma (urealyticum + parvum) – условные патогены;

Mycoplasma genitalium – патогенный микроорганизм, вызывает уретрит (воспаление мочеиспускательного канала).

Для чего используется исследование?

Когда назначается исследование?

При наличии клинических или лабораторных признаков воспалительного процесса урогенитального тракта.

При планирующихся оперативных вмешательствах на органах малого таза с высоким риском развития инфекционных осложнений.

Диагностический поиск при наличии отягощенного акушерского анамнеза (невынашивание беременности, перинатальные потери, бесплодие).

Плановое обследование перед планированием беременности, при подготовке к процедуре экстракорпорального оплодотворения.

Мониторинг эффективности проводимой терапии, восстановления нормоценоза.

Что означают результаты?

КВМ – контроль взятия материала. Необходимым условием качественного ПЦР-исследования считается правильное взятие биоматериала. Показателем адекватности полученного образца является достаточное количество ДНК человека, которая в процессе реакции выделяется из клеток, выстилающих слизистую оболочку и попадающих в пробу при правильном взятии мазка. Показатель КВМ менее 10 4 свидетельствует о недостоверных результатах ПЦР, в таких случаях рекомендуется повторное взятие биоматериала.

ОБМ (общая бактериальная масса) – общее количество бактерий, имеющихся в исследуемом образце. Снижение ОБМ ниже пороговых значений свидетельствует о недостаточном заселении данного локуса бактериями, в том числе вследствие антибиотикотерапии или гормональных нарушений.

Оценка условно-патогенной флоры. Количество аэробных и анаэробных бактерий также оценивается в абсолютных и относительных показателях. Относительный показатель высчитывается по разнице между десятичными логарифмами микроорганизма или их группы и ОБМ. По уровню относительной величины определяется незначительное, умеренное и значительное повышение.

Оценка микоплазм, уреаплазм и грибов рода Candida проводится только по абсолютному показателю, при превышении определенного порога (10 3 для Candida, 10 4 для микоуреаплазм) аппарат фиксирует положительный результат.

Для более удобной интерпретации результатов исследования используется специальная цветовая маркировка:

контрольные показатели: белый – соответствие критериям, красный – несоответствие;

условно-патогенные микроорганизмы и дрожжеподобные грибы: белый – соответствие критериям нормы, желтый – умеренное отклонение, красный – выраженное отклонение от нормы;

нормальная флора (лактобациллы): зеленый – нормоценоз (соответствие критериям нормы), желтый – умеренный дисбиоз (умеренное отклонение от нормы), красный – выраженный дисбиоз;

патогенные микроорганизмы: белый – не обнаружены, красный – обнаружены.

По результатам исследования автоматически дается характеристика состояния микрофлоры: нормоценоз, умеренный или выраженный дисбаланс, который по этиологической структуре может быть анаэробным, аэробным и смешанным.

Микроскопическое исследование отделяемого мочеполовых органов женщин (микрофлора), 3 локализации

Исследование микробиоценоза влагалища с определением чувствительности к антибиотикам

Chlamydia trachomatis, ДНК [реал-тайм ПЦР]

Neisseria gonorrhoeae, ДНК [реал-тайм ПЦР]

Trichomonas vaginalis, ДНК [реал-тайм ПЦР]

Кто назначает исследование?

Гинеколог, репродуктолог, врач общей практики.

Источник

Критерии диагностики бактериального вагиноза с использованием теста Фемофлор-16

Полный текст

Аннотация

Актуальность. Бактериальный вагиноз (БВ) — это нарушение баланса вагинальной микрофлоры, ассоциированное с рядом инфекционных заболеваний урогенитального тракта и неблагоприятными исходами беременности. В нашей стране для выявления дисбиотических состояний влагалища широко используется тест Фемофлор-16 (ДНК-Технология, Москва), однако в алгоритмах интерпретации результатов этого теста не предусмотрена категория БВ.

Цель — разработка диагностических критериев определения БВ при анализе отделяемого влагалища тестом Фемофлор-16.

Материалы и методы. В исследовании участвовали женщины репродуктивного возраста, обратившиеся к акушеру-гинекологу с жалобами на выделения из половых путей. Для клинической диагностики БВ использовали критерии Амселя, лабораторный анализ на БВ производили путем микроскопического исследования отделяемого влагалища с применением метода Нуджента. Образцы отделяемого влагалища от всех женщин анализировали с применением теста Фемофлор-16, предназначенного для характеристики микробиоценоза влагалища методом мультиплексной количественной ПЦР в реальном времени.

Результаты. В исследование было включено 280 женщин. БВ был выявлен у 86 женщин (31 %) с применением критериев Амселя, у 81 женщины (29 %) с применением метода Нуджента. Ассоциация с БВ была установлена для всех групп анаэробных бактерий, включенных в тест Фемофлор-16, за исключением бактерий рода Mobiluncus, которые выявляются в совокупности с филогенетически родственными, но не связанными с БВ бактериями рода Corynebacterium. Низкое содержание лактобацилл ( 1 %), и/или Eubacterium (> 2 %), и/или Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium (> 0,1 %), и/или Megasphaera/Veillonella/Dialister (> 0,1 %), и/или Lachnobacterium/Clostridium (> 0,1 %), и/или Peptostreptococcus (> 0,1 %), и/или Atopobium vaginae (> 0,2 %) определяли БВ с чувствительностью 99 % и специфичностью 93 %.

Заключение. Разработаны критерии диагностики БВ с применением теста Фемофлор-16, которые позволяют с чувствительностью 99 % и специфичностью 93 % установить БВ или исключить его. Данные критерии БВ и критерии производителей теста Фемофлор-16 для категории выраженного анаэробного дисбиоза в значительной степени описывают одну и ту же категорию микробиоценоза влагалища.

Ключевые слова

Полный текст

Введение

Бактериальный вагиноз (БВ) — основная причина патологических выделений из влагалища у женщин репродуктивного возраста. Исследования последних лет показывают, что БВ сопряжен с рядом воспалительных заболеваний органов мочеполового тракта и является одной из частых причин осложнений беременности [1–4]. Распространенность заболевания широко варьирует (от 7 до 68 %) в зависимости от региона, этнической/расовой принадлежности, а также обследуемой популяции [5].

Основным методом клинической диагностики БВ является метод Амселя [6]. Для лабораторной диагностики используют главным образом метод Нуджента, основанный на определении бактериальных морфотипов при микроскопии окрашенных по Граму препаратов [7]. В нашей стране эти методы используются очень редко.

Бактериальный вагиноз представляет собой нарушение баланса между физиологической микрофлорой влагалища, представленной преимущественно лактобациллами, и условно патогенной микрофлорой, в норме обнаруживаемой во влагалище в небольшом количестве. Применительно к таким состояниям в отечественной литературе часто используется термин «дисбиоз влагалища». Другим известным дисбиозом влагалища является аэробный вагинит (АВ). Сходство БВ с АВ заключается в том, что при обоих состояниях наблюдается уменьшение количества лактобацилл, приводящее к снижению концентрации молочной кислоты и, соответственно, повышению рН среды влагалища, и их замещение условно патогенными микроорганизмами. Различия между этими заболеваниями существенны. Для БВ характерны отсутствие воспаления и присутствие большого количества анаэробной микрофлоры (типично выявляются Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, представители родов Prevotella, Megasphaera, Leptotrichia, Sneatia, Mobiluncus и др.). Аэробный вагинит в его типичном проявлении характеризуется повышенным воспалительным ответом и/или выраженными признаками атрофии эпителия влагалища и наличием умеренного количества комменсальной кишечной микрофлоры [8]. Чаще всего при АВ выявляются стрептококки (до 59 % случаев), Staphylocuccus aureus (до 42 %), коагулазаотрицательные стафилококки (до 37 %), Escherichia coli (до 23 %) [9].

В нашей стране в последние годы для выявления дисбиотических состояний влагалища широко используется тест отечественного производства Фемофлор-16 (ДНК-Технология, Москва). Тест основан на мультиплексной количественной ПЦР в реальном времени. С помощью теста определяют тотальную концентрацию бактериальной ДНК — общую бактериальную массу (ОБМ) и концентрацию (абсолютную и относительную) следующих видов/родов микроорганизмов: Lactobacillus, Enterobacteriaceae, Streptococcus, Staphylococcus, Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas, Eubacterium, Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium, Megasphaera/Veillonella/Dialister, Lachnobacterium/Clostridium, Corynebacterium/Mobiluncus, Peptostreptococcus, Atopobium vaginae. По соотношению этих бактерий определяется состояние микробиоценоза влагалища — нормоценоз или дисбиоз. Дисбиоз, в свою очередь, оценивается по степени выраженности (умеренный или выраженный дисбиоз) и преобладанию аэробной или анаэробной условно патогенной микрофлоры (аэробный или анаэробный дисбиоз соответственно). Кроме того, оценивается абсолютная концентрация микроорганизмов Mycoplasma hominis, Ureaplasma и Candida, наличие ДНК которых в концентрации > 104 геном-эквивалентов в образце в отсутствие другой условно патогенной микрофлоры дает основание относить нормоценоз к категории условного.

Алгоритмы интерпретации результатов теста Фемофлор-16 не включают категорию БВ. Однако для ведения пациента, основанного на принципах доказательной медицины, лабораторное заключение должно давать информацию, позволяющую с высокой точностью установить или опровергнуть определенный общепринятый диагноз. Целью исследования явилась разработка диагностических критериев определения БВ при анализе отделяемого влагалища тестом Фемофлор-16.

Материалы и методы

В исследовании участвовали женщины репродуктивного возраста, обратившиеся к аку шеру-гинекологу с жалобами на дискомфорт и выделения из половых путей в поликлиническое отделение ФГБНУ «Научно-исследова тельский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта» и СПб ГБУЗ «Городская поликлиника № 34». Критериями исключения являлись беременность и применение антибактериальных препаратов в течение последних четырех недель.

Клиническим материалом для исследования служило отделяемое влагалища, которое получали с помощью двух дакроновых тампонов. Содержимое одного тампона наносили на предметное стекло для микроскопического исследования. Содержимое второго тампона использовали для анализа с применением теста Фемофлор-16.

Для клинической диагностики БВ использовали критерии Амселя [6] с небольшой модификацией, заключавшейся в том, что для определения ключевых клеток в отделяемом влагалища использовали не нативный, а окрашенный по Граму препарат. При выполнении как минимум трех из четырех критериев, а именно наличия специфических выделений из влагалища, повышенного pH влагалища (> 4,5), положительного аминного теста; наличия «ключевых» клеток при микроскопическом исследовании отделяемого влагалища, устанавливали диагноз БВ.

Лабораторный анализ на БВ производили путем исследования отделяемого влагалища с применением метода Нуджента [7]. В окрашенных по Граму препаратах определяли следующие бактериальные морфотипы: крупные грамположительные палочки (морфотип лактобациллы), небольшие грамотрицательные или грамвариабельные кокки и коккобациллы (морфотип Gardnerella и Bacteroides) и грамотрицательные или грамвариабельные изогнутые палочки (морфотип Mobiluncus). В зависимости от суммы баллов образцы расценивали как нормальную микрофлору (число баллов от 0 до 3), промежуточную микрофлору (число баллов от 4 до 6) и БВ (число баллов от 7 до 10).

Анализ образцов отделяемого влагалища с использованием теста Фемофлор-16 проводили в соответствии с инструкцией производителя. Интерпретацию результатов осуществляли с применением алгоритма производителя (см. рис. 1).

Рис. 1. Алгоритм интерпретации результатов теста Фемофлор-16

При разработке диагностических критериев БВ количество всех микроорганизмов, за исключением M. hominis, Ureaplasma и Candida, было представлено как соотношение концентрации их ДНК к ОБМ в долях единицы. Количество M. hominis, Ureaplasma и Candidaпредставляли в абсолютных значениях концентрации ДНК (геном-эквивалентов в образце). Для изучения ассоциации микроорганизмов/групп микроорганизмов, определяемых тестом Фемофлор-16, с БВ проводили анализ корреляции их количества с клиническими и микроскопическими показателями БВ: числом баллов по шкале Нуджента, суммой положительных критериев Амселя и со значениями рН влагалища. Для оценки способности потенциальных бактериальных маркеров, определяемых с применением теста Фемофлор-16, правильно классифицировать образцы с нормальной микрофлорой и БВ использовали ROC-анализ (ROC — receiver operating characteristic). Оптимальный порог содержания бактерий определяли по максимальной пропорции правильно классифицированных образцов. Статистический анализ результатов осуществляли с использованием статистических пакетов Statistica (StatSoft) и SPSS (IBM).

Результаты

В исследование было включено 280 женщин в возрасте от 20 до 45 лет (29 ± 5,7 года). С использованием критериев Амселя БВ был выявлен у 86 женщин, 194 женщины не имели БВ. Согласно классификации вагинальных проб по методу Нуджента 172 образца были причислены к категории нормальной микрофлоры, 27 — промежуточной микрофлоры, 81 — БВ (табл. 1).

Таблица 1. Результаты исследования отделяемого влагалища с использованием методов Амселя и Нуджента

Table 1. Results of the analysis of vaginal samples using the Amsel criteria and Nugent score

Категория по Амселю

Категория по Нудженту

Пробы от всех женщин были протестированы с использованием теста Фемофлор-16. Результаты 10 проб были признаны невалидными ввиду низкого значения контроля взятия материала и исключены из анализа. Таким образом, в анализ было включено 270 проб. Из них 164 пробы были из категории нормальной микрофлоры по Нудженту, 26 — промежуточной микрофлоры и 80 — БВ. В соответствии с алго ритмами интерпретации результатов теста Фемофлор-16 100 случаев были классифицированы как нормоценоз, 24 — условный нормоценоз, 45 — умеренный дисбиоз (44 — анаэробный, 1 — аэробный), 101 — выраженный дисбиоз (90 — анаэробный, 8 — аэробный, 3 — смешанный) (табл. 2).

Таблица 2. Результаты исследования отделяемого влагалища с использованием метода Нуджента и теста Фемофлор-16

Table 2. Results of the analysis of vaginal samples using the Nugent score and Femoflor-16 test

Результат теста Фемофлор-16

Категория по Нудженту

Умеренный анаэробный дисбиоз

Умеренный аэробный дисбиоз

Выраженный анаэробный дисбиоз

Выраженный аэробный дисбиоз

Выраженный смешанный дисбиоз

Для изучения ассоциации микроорганизмов/групп микроорганизмов, определяемых тестом Фемофлор-16, с БВ был проведен анализ корреляции их количества с клиническими и микроскопическими показателями БВ, а именно числом баллов по шкале Нуджента, суммой положительных критериев Амселя и со значениями рН влагалища (рис. 2, 3).

Рис. 2. Коэффициенты корреляции (r) количества микроорганизмов/групп микроорганизмов, определяемых тестом Фемофлор-16, с количественными показателями бактериального вагиноза. ОБМ — общая бактериальная масса

Рис. 3. Статистическая значимость (р) корреляции количества микроорганизмов/групп микроорганизмов, определяемых тестом Фемофлор, с количественными показателями бактериального вагиноза. ОБМ — общая бактериальная масса

Отрицательная корреляция с БВ была установлена для соотношения Lactobacillus/ОБМ. Анаэробные бактерии/группы бактерий предсказуемо показали положительную корреляцию с БВ, при этом самые высокие коэффициенты корреляции наблюдались для групп Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas, Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium и Megasphaera/Veillo nella/Dialister. Положительная корреляция с БВ также наблюдалась для M. hominis. Из бактерий, традиционно связываемых с БВ, Mobiluncus не показал значимой корреляции ни с одним из показателей БВ, что может быть связано с тем, что эти бактерии в тесте Фемофлор-16 выявляются в совокупности с филогенетически родственными, но не связанными с БВ бактериями рода Corynebacterium. Содержание ДНК аэробных бактерий кишечной группы (энтеробактерий, стрептококков и стафилококков), а также уреаплазм и дрожжеподобных грибов рода Candida ожидаемо не коррелировало с показателями БВ.

Следующим этапом нашего анализа была оценка способности бактериальных маркеров, определяемых с применением теста Фемо флор-16, правильно классифицировать образцы с нормальной микрофлорой и БВ. Для этой цели был использован ROC-анализ. В качестве референтного стандарта применяли метод Нуд жента. Так как определение диагностических характеристик требует бинарной классификации случаев («есть болезнь» или «нет болезни»), случаи промежуточной микрофлоры по Нудженту были исключены из анализа. В анализ включили ОБМ и относительную концентрацию ДНК бактерий, показавших значительную корреляцию с БВ, а именно лактобацилл и всех групп анаэробных бактерий, за исключением Corynebacterium/Mobiluncus. Вычисляли значения площади под ROC-кривой, а также значения чувствительности и специфичности при оптимальном пороге относительной концентрации ДНК.

Самую высокую диагностическую точность (площадь под ROC-кривой превышает значение 0,9, что рассматривается как отличная диагностическая точность) продемонстрировали следующие маркеры: соотношение лактобацилл и ОБМ (площадь под ROC-кривой 0,996), Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyro monas/ОБМ (0,975), Eubacterium/ОБМ (0,942), Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium/ОБМ (0,907), Megasphaera/Veillonella/Dialister/ОБМ (0,934) и Atopobium vaginae/ОБМ (0,908) (рис. 4). Мар керы Lachnobacterium/Clostridium/ОБМ и Pepto streptococcus/ОБМ обладали удовлетворительной (площадь под ROC-кривой 0,775) и хорошей (0,850) диагностической точностью соответственно. Общая бактериальная масса и концентрация M. hominis показали низкую диагностическую точность (площадь под ROC-кривой ниже 0,7).

Рис. 4. ROC-анализ способности бактериальных маркеров, определяемых тестом Фемофлор-16, выявлять бактериальный вагиноз. Чем ближе ROC-кривая к верхнему левому углу (точка 100 % чувствительности и 100 % специфичности), тем выше точность классификатора

Для маркеров с площадью под ROC-кривой выше 0,7 был рассчитан оптимальный порог относительной концентрации и показатели чувствительности и специфичности при данном пороге (табл. 3). Самые высокие показатели чувствительности и специфичности были показаны для соотношения концентрации ДНК лактобацилл к ОБМ. При пороге 0,01 (т. е. при содержании выше 1 %). Чувствительность остальных маркеров варьировала от 39 до 80 %, специфичность — от 93 до 99 %.

Таким образом, низкое содержание лактобацилл является самым чувствительным и специ фичным критерием БВ. Однако необходимо учитывать, что при расчете диагностических характеристик мы исключили промежуточную категорию по Нудженту, в которую входит большинство проб из категории «выраженный аэробный и смешанный дисбиоз с высоким содержанием аэробных бактерий», также характеризующихся низким содержанием лактобацилл. В связи с этим использование соотношения лактобацилл к ОБМ как единственного критерия может приводить к ложноположительным результатам, хотя и немногочисленным. Принимая во внимание этот факт, представляется целесообразным рассматривать микрофлору влагалища как соответствующую БВ, если выполняются два условия: низкое содержание лактобацилл и повышенное содержание (выше порога, обозначенного в табл. 3) как минимум одного из бактериальных маркеров БВ.

Таблица 3. Диагностическая точность бактериальных маркеров, выявляемых с применением теста Фемофлор-16, для определения бактериального вагиноза

Table 3. Diagnostic accuracy of the bacterial markers detected by Femoflor-16 test for bacterial vaginosis

Площадь под ROC-кривой

Примечание: ОБМ — общая бактериальная масса

Для того чтобы оценить чувствительность и специфичность предлагаемого подхода к диагностике БВ, мы включили в анализ промежуточную микрофлору по Нудженту, объединив ее с нормальной микрофлорой. Иначе говоря, все случаи были разделены на БВ (n = 80) и отсутствие БВ (n = 190). Если в качестве критерия БВ использовали только низкое содержание лактобацилл, чувствительность и специфичность выявления БВ равнялись 99 и 89 % соответственно (табл. 4). Когда же в качестве критерия БВ использовали низкое содержание лактобацилл в совокупности с повышенным содержанием анаэробных бактерий, количество ложноположительных случаев ожидаемо уменьшилось (с 20 до 13), что привело к повышению специфичности до 93 %.

Таблица 4. Чувствительность и специфичность диагностических критериев бактериального вагиноза с использованием теста Фемофлор-16

Table 4. Sensitivity and specificity of the diagnostic criteria for bacterial vaginosis using Femoflor-16 test

Категория по Нудженту

отсутствие бактериального вагиноза (нормальная и промежуточная микрофлора)

бактериаль ный вагиноз

Низкое содержание лактобацилл

Низкое содержание лактобацилл в совокупности с повышенным содержанием анаэробных бактерий

Заключительным этапом нашей работы было сопоставление разработанных нами критериев выявления БВ с критериями производителя теста для выраженного анаэробного дисбиоза, который неформально приравнивается к БВ. Из 92 проб, интерпретированных нами как БВ, 87 проб были отнесены к категории выраженного анаэробного дисбиоза, 2 — выраженного аэробного дисбиоза, 3 — выраженного смешанного дисбиоза. В то же время 3 из 90 проб из категории выраженного анаэробного дисбиоза были интерпретированы нами как отсутствие БВ (табл. 5). Таким образом, разработанные в данном исследовании диагностические критерии БВ и критерии, разработанные производителями теста Фемофлор, в значительной степени описывают одну и ту же категорию микробиоценоза влагалища.

Таблица 5. Сопоставление категорий микробиоценоза влагалища, определенных с помощью критериев бактериального вагиноза, и результатов теста Фемофлор-16

Table 5. Comparison of the categories of the vaginal microbiocenosis determined using the criteria for bacterial vaginosis with the results of Femoflor-16 test

Результат теста Фемофлор-16

Разработанные в данном исследовании критерии бактериального вагиноза

отсутствие бактериального вагиноза

Умеренный анаэробный дисбиоз

Умеренный аэробный дисбиоз

Выраженный анаэробный дисбиоз

Выраженный аэробный дисбиоз

Выраженный смешанный дисбиоз

Обсуждение результатов

В последние годы молекулярные методы активно внедряются в диагностику урогенитальных инфекций, в том числе ассоциированных с условно патогенными микроорганизмами. Условно патогенная микрофлора влагалища является частью эндогенной (нормальной) микрофлоры, поэтому при анализе связанных с ней дисбиотических состояний необходимо учитывать ее количественный состав. Тест Фемофлор-16, основанный на количественной ПЦР в реальном времени, был внедрен в клиническую лабораторную диагностику в 2009 г. и нашел достаточно широкое применение. Тест обладает рядом преимуществ перед традиционными методами выявления нарушений микробиоценоза влагалища — бактериологическим и микроскопическим. Его преимущества перед обоими методами заключаются в высоком уровне стандартизации анализа и интерпретации результатов, исключении фактора субъективности, точной количественной оценке. От бактериологического метода тест Фемофлор-16 отличается также быстротой анализа, возможностью выявлять некультивируемые и трудно культивируемые микроорганизмы. Далее, тест позволяет дифференцировать бактерии, имеющие сходные морфотипы и поэтому неразличимые при бактериоскопии. Суммируя вышесказанное, можно утверждать, что тест дает возможность быстрой, объективной, стандартизованной характеристики микробиоценоза влагалища.

Лабораторное заключение исследования отделяемого влагалища тестом Фемофлор-16 включает следующие основные категории вагинальной микрофлоры: нормоценоз (включая условный нормоценоз), умеренный дисбиоз (анаэробный и аэробный) и выраженный дисбиоз (анаэробный и аэробный). Инициируя данное исследование, мы исходили из убеждения, что тест Фемофлор-16 обладает потенциалом достаточно точно выявлять два основных нарушения баланса вагинальной микрофлоры — БВ и АВ. Данную работу мы посвятили разработке критериев диагностики БВ. По нашему мнению, с помощью теста возможно, после разработки соответствующих критериев, с высокой долей определенности выявлять тип вагинальной микрофлоры, соответствующий аэробному вагиниту (для точной диагностики аэробного вагинита необходима также оценка воспалительной реакции).

Первым этапом нашего анализа была оценка ассоциации выявляемых микроорганизмов/групп микроорганизмов с БВ. Все группы анаэробных бактерий, за исключением группы Corynebacterium/Mobiluncus, коррелировали в той или иной степени с БВ. Оба рода бактерий принадлежат порядку Actinomycetales класса Actinobacteria, однако Mobiluncus spp. ассоциирован с БВ, а Corynebacterium spp. — нет. Результаты метагеномных исследований микрофлоры влагалища свидетельствуют, что содержание бактерий рода Corynebacterium в некоторых случаях, хоть и немногочисленных, может быть существенным, выше 10 % [10]. В связи с этим совокупное выявление Mobiluncus spp. и Corynebacterium spp. может приводить к необоснованному заключению о дисбиотическом состоянии влагалища.

Далее, нами были разработаны критерии, которые позволяют с чувствительностью 99 % и специфичностью 93 % установить диагноз БВ или исключить его. Необходимо отметить, что при оценке разработанных критериев мы объединили категории нормальной и промежуточной микрофлоры по Нудженту, определив эту сборную категорию как отсутствие БВ. Известно, что категория промежуточной микрофлоры по Нудженту неоднородна по своему составу, и на сегодняшний день нет единого мнения относительно ведения пациенток с данной категорией вагинальной микрофлоры. Полагают, что эта категория содержит по большей части микрофлору, соответствующую аэробному вагиниту, а также действительно промежуточную микрофлору, т. е. переходную от нормы к БВ [8]. Наши результаты служат этому косвенным подтверждением: 5 из 8 случаев (63 %) выраженного аэробного дисбиоза, определенных тестом Фемофлор-16, вошли в категорию промежуточной микрофлоры по Нудженту. Важно отметить, что при сопоставлении результатов тестирования на БВ с использованием разработанных нами критериев и тестирования на выраженный анаэробный дисбиоз (неформально приравнивается к БВ) с использованием критериев производителя теста количество дискордантных результатов было относительно небольшим.

Еще одним побудительным мотивом для данного исследования послужили трудности, испытываемые клиницистами при интерпретации категории умеренного дисбиоза, которая подразумевает промежуточное состояние между нормоценозом и выраженным дисбиозом. Особенно проблематичной является категория умеренного анаэробного дисбиоза, так как она выявляется довольно часто. Так, в нашем исследовании 44 из 270 случаев (16 %) были отнесены к этой категории. Сравнение результатов теста Фемофлор-16 и метода Нуджента показало, что подавляющее большинство проб из категории умеренного анаэробного дисбиоза (37 из 44, 84 %) были классифицированы как нормальная микрофлора по шкале Нуджента и только 6 случаев (14 %) были отнесены к категории промежуточной микрофлоры, и один случай (2 %) — к категории БВ. На наш взгляд, категория промежуточного состояния, определяемая тестом Фемофлор-16 как умеренный дисбиоз, должна быть сужена и включать только пограничные, трудно интерпретируемые случаи.

В порядке дискуссии хотелось бы отметить существенный потенциал теста Фемофлор-16 для анализа вагинальной микрофлоры в научных целях, который, на наш взгляд, несколько ограничен тем, что Gardnerella vaginalis — факультативный анаэроб, представитель поряд ка Bifidobacteriales класса Actinobacteria — выявляется в совокупности с Prevotella bivia и Porphyromonas spp. — облигатными анаэробными бактериями порядка Bacteroidales класса Bacteroidetes. К ограничениям подобного рода также можно отнести уже упомянутое совместное выявление бактерий рода Corynebacterium с бактериями рода Mobiluncus.

Таким образом, нами разработаны критерии диагностики БВ с применением теста Фемофлор-16, предназначенного для характеристики микробиоценоза влагалища. Низкое содержание лактобацилл ( 1 %), и/или Eubacterium (> 2 %), и/или Sneathia/Leptotrichia/Fusobacterium (> 0,1 %), и/или Megasphaera/Veillonella/Dialister (> 0,1 %), и/или Lachnobacterium/Clostridium (> 0,1 %), и/или Peptostreptococcus (> 0,1 %), и/или Atopobium vaginae (> 0,2 %) определяют БВ с чувствительностью 99 % и специфичностью 93 %. Данные критерии БВ и критерии, разработанные производителями теста Фемофлор-16 для категории выраженного анаэробного дисбиоза, в значительной степени описывают одну и ту же категорию микробиоценоза влагалища.

Источник