Что такое nucleic acid amplification test
Достижения
Нити нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) с соответствующими последовательностями слипаются в попарные цепочки, застегиваясь на молнии, как застежка-липучка в сушилке для одежды. Но каждый узел цепи не очень липкий, поэтому двухцепочечная цепь постоянно частично расстегивается и снова застегивается под воздействием окружающих вибраций (называемых тепловым шумом или броуновским движением ). Более длинные пары более стабильны. В тестах на нуклеиновую кислоту используется «зонд», который представляет собой длинную нить с прикрепленной к ней короткой нитью. Длинная цепь праймера имеет соответствующую (комплементарную) последовательность «целевой» цепи обнаруживаемого болезнетворного организма. Болезненная нить плотно прилипает к обнаженной части длинной праймерной нити (называемой «опорной точкой»), а затем постепенно вытесняет короткую «защитную» нить с зонда. В конце концов, короткая протекторная цепь ни с чем не связана, а несвязанный короткий праймер можно обнаружить. В оставшейся части этого раздела дается некоторая история исследований, необходимых для преобразования этого процесса в полезный тест.
В 2012 году исследовательская группа Инь опубликовала статью об оптимизации специфичности гибридизации нуклеиновых кислот. Они представили «зонд для замены опоры (PC)», который состоит из предварительно гибридизированной цепи комплемента C и протекторной цепи P. Комплементная цепь длиннее, чем протекторная цепь, и на конце имеет несвязанный хвост, опору для ног. Комплемент идеально дополняет целевую последовательность. Когда правильная цель (X) реагирует с зондом для замены опоры (PC), P высвобождается и образуется гибридизированный продукт XC. Стандартная свободная энергия (∆) реакции близка к нулю. С другой стороны, если зонд с заменой опоры (PC) реагирует с ложной мишенью (S), реакция идет вперед, но стандартная свободная энергия увеличивается, становясь менее термодинамически выгодной. Стандартная разность свободной энергии (∆∆) достаточно значительна, чтобы обеспечить очевидную дискриминацию в урожайности. Фактор дискриминации Q рассчитывается как выход правильной целевой гибридизации, деленный на выход ложной целевой гибридизации. В ходе экспериментов с различными зондами для замены опоры на пальцах ног с 5 правильными мишенями и 55 ложными мишенями с энергетически репрезентативными одноосновными изменениями (замены, делеции и вставки) группа Инь пришла к выводу, что факторы дискриминации этих зондов были между 3 и 100+ со средним значением. 26. Зонды надежно функционируют при температурах от 10 ° C до 37 ° C, от 1 мМ до 47 мМ и с концентрациями нуклеиновых кислот от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды с обменом на пальцах ног работают надежно даже при обнаружении РНК.
После этого были изучены дальнейшие исследования. В 2013 году группа Силига опубликовала статью о флуоресцентных молекулярных зондах, в которых также используется реакция обмена пальцами ног. Это позволило оптическое обнаружение правильной цели и цели SNP. Им также удалось обнаружить SNP в образцах, полученных из E. coli.
В 2015 году группа Дэвида достигла чрезвычайно высокой (1000+) селективности однонуклеотидных вариантов (SNV), внедрив систему, называемую «конкурентные композиции». В этой системе они построили модель кинетической реакции основных процессов гибридизации для прогнозирования оптимальных значений параметров, которые варьируются в зависимости от последовательностей SNV и дикого типа (WT), от конструктивной архитектуры зонда и приемника, а также от реагента. концентрации и условия анализа. Их модель преуспела в средней селективности 890 полей для 44 связанных с раком ДНК SNV, минимум 200, что представляет собой по крайней мере 30-кратное улучшение по сравнению с предыдущими анализами, основанными на гибридизации. Кроме того, они применили эту технологию для анализа низких последовательностей VAF из геномной ДНК человека после ПЦР, а также непосредственно для синтетических последовательностей РНК.
Основываясь на опыте, они разработали новый метод ПЦР под названием Blocker Displacement Amplification (BDA). Это термостойкая ПЦР, которая избирательно усиливает все варианты последовательностей в пределах окна примерно 20 нт в 1000 раз по сравнению с последовательностями дикого типа, позволяя легко обнаруживать и количественно оценивать сотни вариантов потенциалов первоначально при частоте аллелей ≤ 0,1%. BDA обеспечивает аналогичную эффективность обогащения при температурах отжига от 56 ° C до 64 ° C. Такая устойчивость к температуре облегчает мультиплексное обогащение множества различных вариантов генома и, кроме того, позволяет использовать недорогие и портативные инструменты термоциклирования для обнаружения редких вариантов ДНК. BDA был подтвержден даже на типах образцов, включая клинические образцы бесклеточной ДНК, взятые из плазмы крови пациентов с раком легких.
Тест на нуклеиновую кислоту
Нити нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) с соответствующими последовательностями слипаются в попарные цепочки, застегиваясь на молнии, как застежка-липучка в сушилке для одежды. Но каждый узел цепи не очень липкий, поэтому двунитная цепь постоянно частично расстегивается и снова застегивается под воздействием окружающих вибраций (называемых тепловым шумом или броуновским движением). Более длинные пары более стабильны. В тестах на нуклеиновую кислоту используется «зонд», представляющий собой длинную цепочку с прикрепленной к ней короткой цепью. Длинная цепь праймера имеет соответствующую (комплементарную) последовательность «целевой» цепи обнаруживаемого болезнетворного организма. Болезненная нить плотно прилипает к обнаженной части длинной праймерной нити (называемой «опорной точкой»), а затем постепенно вытесняет короткую «защитную» нить с зонда. В конце концов, короткая протекторная цепь ни с чем не связана, а несвязанный короткий праймер можно обнаружить. В оставшейся части этого раздела дается некоторая история исследований, необходимых для преобразования этого процесса в полезный тест.
В 2012 году исследовательская группа Инь опубликовала статью об оптимизации специфичности гибридизации нуклеиновых кислот. [3] Они представили «зонд для замены опоры (PC)», который состоит из предварительно гибридизированной цепи комплемента C и протекторной цепи P. Комплементная цепь длиннее, чем протекторная цепь, и на конце имеет несвязанный хвост, опору для ног. Комплемент идеально дополняет целевую последовательность. Когда правильная цель (X) реагирует с зондом для замены опоры (PC), P высвобождается и образуется гибридизированный продукт XC. Стандартная свободная энергия (∆) реакции близка к нулю. С другой стороны, если датчик замены опоры (PC) реагирует с ложной мишенью (S), реакция идет вперед, но стандартная свободная энергия увеличивается, становясь менее термодинамически выгодной. Стандартная разница свободной энергии (∆∆) достаточно значительна, чтобы обеспечить очевидную дискриминацию в урожайности. Фактор дискриминации Q рассчитывается как выход правильной целевой гибридизации, деленный на выход ложной целевой гибридизации. В ходе экспериментов с различными зондами замены опоры для пальцев с 5 правильными мишенями и 55 ложными мишенями с энергетически репрезентативными одноосновными изменениями (замены, делеции и вставки) группа Инь пришла к выводу, что факторы дискриминации этих зондов были между 3 и 100+ со средним 26. Зонды надежно функционируют при температурах от 10 ° C до 37 ° C, от 1 мМ до 47 мМ и при концентрациях нуклеиновых кислот от 1 нМ до 5 М. Они также выяснили, что зонды с обменом на пальцах ног работают надежно даже при обнаружении РНК.
После этого были изучены дальнейшие исследования. В 2013 году группа Силига опубликовала статью о флуоресцентных молекулярных зондах, в которых также используется реакция обмена пальцами ног. [4] Это позволило оптическое обнаружение правильной цели и цели SNP. Им также удалось обнаружить SNP в образцах, полученных из E. coli.
В 2015 году группа Дэвида достигла чрезвычайно высокой (1000+) селективности однонуклеотидных вариантов (SNV), внедрив систему, называемую «конкурентные композиции». [5] В этой системе они построили модель кинетической реакции лежащих в основе процессов гибридизации для прогнозирования оптимальных значений параметров, которые варьируются в зависимости от последовательностей SNV и дикого типа (WT), от конструктивной архитектуры зонда и приемника и от концентраций реагентов и условий анализа. Их модель преуспела в средней селективности 890 полей для 44 связанных с раком ДНК SNV, минимум 200, что представляет собой по крайней мере 30-кратное улучшение по сравнению с предыдущими анализами, основанными на гибридизации. Кроме того, они применили эту технологию для анализа низких последовательностей VAF из геномной ДНК человека после ПЦР, а также непосредственно для синтетических последовательностей РНК.
Основываясь на опыте, они разработали новый метод ПЦР под названием Blocker Displacement Amplification (BDA). [6] Это термостойкая ПЦР, которая избирательно амплифицирует все варианты последовательностей в пределах окна примерно 20 нт в 1000 раз по сравнению с последовательностями дикого типа, что позволяет легко обнаруживать и количественно определять сотни вариантов потенциалов первоначально при частоте аллелей ≤ 0,1%. BDA обеспечивает аналогичную эффективность обогащения при температурах отжига от 56 ° C до 64 ° C. Такая устойчивость к температуре облегчает мультиплексное обогащение множества различных вариантов генома и, кроме того, позволяет использовать недорогие и портативные инструменты термоциклирования для обнаружения редких вариантов ДНК. BDA был подтвержден даже на типах образцов, включая клинические образцы бесклеточной ДНК, взятые из плазмы крови пациентов с раком легких.
Nucleic Acid Amplification Tests (NAATs)
Summary of Recent Changes
A Nucleic Acid Amplification Test, or NAAT, is a type of viral diagnostic test for SARS-CoV-2, the virus that causes COVID-19. NAATs detect genetic material (nucleic acids). NAATs for SARS-CoV-2 specifically identify the RNA (ribonucleic acid) sequences that comprise the genetic material of the virus.
NAATs for SARS-CoV-2 test specimens from either the upper or lower respiratory tract. The type of specimen collected when testing for SARS-CoV-2 is based on the test being performed and the manufacturer’s instructions. See CDC’s Collecting and Handling of Clinical Specimens for COVID-19 Testing.
The NAAT procedure works by first amplifying – or making many copies of – the virus’s genetic material, if any is present in a person’s specimen. Amplifying those nucleic acids enables NAATs to detect very small amounts of SARS-CoV-2 RNA in a specimen, making these tests highly sensitive for diagnosing COVID-19. In other words, NAATs can reliably detect small amounts of SARS-CoV-2 and are unlikely to return a false-negative result of SARS-CoV-2.
NAATs can use many different methods to amplify nucleic acids and detect the virus, including but not limited to:
Since the beginning of the COVID-19 pandemic, both the number and types (methods and technologies external icon ) of NAATs authorized for emergency use by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for the detection of SARS-CoV-2 have increased. The FDA will likely authorize additional NAAT methods in the future.
NAATs have been authorized for use in different settings, such as in laboratory facilities by trained personnel (laboratory-based) or in point-of-care (POC) settings. Some NAATs can even be self-administered at home or in other non-healthcare locations. Some NAATs are considered rapid tests that are performed at or near the place where the specimen is collected and can provide the result within minutes, whereas the time to complete laboratory-based NAATs ranges from less than an hour to more than a day. The level of sensitivity for the detection of SARS-CoV-2 genetic material in a specimen also varies depending on the methods and application of the NAAT. Sensitivity varies by test, but laboratory-based NAATs generally have higher sensitivity than POC tests or self-administered tests.
Because laboratory-based NAATs are considered the most sensitive tests for detecting SARS-CoV-2, they can also be used to confirm the results of lower sensitivity tests, such as POC NAATs or antigen tests.
If POC NAATs do not deliver presumptive results, they can be used for confirmatory testing. If the testing environment does not have the resources or the ability to access laboratory-based NAATs, POC NAATs can also be used for confirmatory testing. Saliva is an acceptable specimen type for SARS-CoV-2 testing, and some NAATs have been authorized for use with saliva specimens that provide definitive diagnostic and screening results. However, saliva specimen quality can be highly variable, which can affect the performance of the test. CDC recommends collecting and testing an upper respiratory specimen, such as nasopharyngeal, nasal mid-turbinate, or anterior nasal, when using NAATs for confirmatory testing. In cases of discordant test results from different types of tests, results from laboratory-based NAATs should be prioritized over any POC or self-administered test.
If a person receives two or more discordant laboratory-based NAAT results within a 48-hour period, the person should contact a healthcare provider or the local or state health department for test interpretation and clinical guidance on what steps to take.
COVID-19 Viral Testing Tool
A tool to help healthcare providers quickly access the most relevant, actionable information to determine what type(s) of COVID-19 testing they should recommend. After test results are in, the tool can help interpret test results and guide next steps.
Методы тестирования на COVID-19 и их ограничения — отчет ECDC
European Centre for Disease Prevention and Control: COVID-19 testing strategies and objectives. 15 September 2020. ECDC: Stockholm, 2020
Лица из ECDC, которые участвовали в написании этого документа (в алфавитном порядке): Cornelia Adlhoch, Eeva Broberg, Bruno Ciancio, Lisa Ferland, Tjede Funk, Irina Jovel Quinonez Dalmau, Pete Kinross, Katrin Leitmeyer, Angeliki Melidou, Lina Nerlander, Anastasia Pharris, Diamantis Plachouras, Gianfranco Spiteri, Carl Suetens, Ivo Van Walle
Консультация: Weronika Rymer, Agnieszka Wroczyńska, Bogdan Solnica, Anna Mertas, Jerzy Jaroszewicz
Сокращения: ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения, ЕС — Европейский союз, ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, COVID‑19 (coronavirus disease) — заболевание, вызываемое SARS-CoV-2, ECDC – European Centre for Disease Prevention and Control, NAAT (nucleic acid amplification tests) — амплификационное тестирование нуклеиновых кислот, POCT (point-of-care testing) — тестирование в месте оказания медицинской помощи, SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) — коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2
Период инкубации
Еще две важные характеристики тестов — это скорость и простота выполнения. Технические спецификации медицинских устройств для диагностики in vitro (Решение Комиссии 2002/364/EC) 5 определяют быстрые тесты как тесты, которые «могут выполняться только на отдельных образцах или небольшими партиями и предназначены для быстрого получения результата при проведении в непосредственной близости от пациента». Согласно подготовленному ВОЗ первоначальному профилю тестов, проводимых в месте оказания помощи пациентам (POCT — тесты, которые можно проводить непосредственно при пациенте, например, дома, рядом с больничной койкой, в кабинете врача — прим. ред.), для людей с подозрением на COVID- 19 и контактных лиц, такой тест должен соответствовать следующим требованиям: 6
1. целевые условия выполнения
a) допустимые — тест может проводиться вне лаборатории, как в постоянных, так и в специальных пунктах сегрегации/скрининга, проводимых в медицинских учреждениях, например, в отделениях неотложной помощи больниц, в мобильных подразделениях и вне медицинских учреждений (мониторинг контактных лиц) медицинским персоналом или лаборантами, прошедшими соответствующую подготовку по забору проб материала, биобезопасности и проведению исследований
б) желаемые — такие же, как и допустимые; кроме того, тест может проводиться обученным немедицинским персоналом (волонтерами/общественными работниками);
2. время ожидания результата:
а) допустимое ≤40 минут
б) желаемое ≤20 минут.
Алгоритмы проведения исследований
Чтобы упростить процесс тестирования и повысить его эффективность, помимо однократного анализа одной пробы, можно использовать комбинацию нескольких тестов (то есть алгоритм тестирования). Следующие 3 алгоритма наиболее полезны.
Быстрый тест (экспресс-тест) с последующим проведением подтверждающего теста с тем же образцом
Цель экспресс-теста — эффективно выявить высокий процент заражений и без промедления принять соответствующие меры контроля. Такой тест должен быть очень специфичным, чтобы избежать ложноположительных результатов, но на практике он обычно характеризуется низкой чувствительностью. Таким образом, существует высокая вероятность того, что отрицательный результат экспресс-теста будет ложноотрицательным, в то время как положительный результат скорее всего будет истинно положительным. Затем может быть проведен подтверждающий тест с высокой чувствительностью и высокой специфичностью — обычно это молекулярный тест, который не является экспресс-тестом и выполняется в лаборатории — с использованием образцов, результаты исследования которых с помощью экспресс-теста были отрицательными, для выявления дополнительных случаев инфицирования. Положительный результат экспресс-теста, согласно определению случая, требует подтверждения с помощью ОТ-ПЦР.
Групповое тестирование образцов
Групповое тестирование (пулирование) образцов является более быстрым методом, чем анализ отдельных образцов, а также экономит ресурсы в ситуациях, когда ожидаемый процент положительных результатов очень низок (≤5 %). 7, 8 Метод заключается в объединении большего количества образцов с сохранением части материала или второго образца от каждого исследуемого. Частота получения положительного результата группового исследования зависит от эпидемиологической ситуации. Если получен такой результат, образцы следует тестировать индивидуально.
В качестве альтернативы образцы могут быть помещены в несколько пулов, результаты которых вместе определяют положительный образец.
Продолжение исследований и время проведения тестирования
Под продолжением тестирования мы подразумеваем выполнение более одного теста в разное время у данного человека, чтобы повысить вероятность обнаружения инфекции. Основная цель такого алгоритма тестирования — выявить случаи бессимптомных и предсимптомных инфекций. Положительный результат не будет получен сразу после заражения, а только после достаточной репликации вируса, когда в собранном образце присутствует достаточное количество РНК или антигена SARS-CoV-2. Также важен предел обнаружения используемого теста. Однако в некоторых ситуациях невозможно определить, прошло ли достаточное время с момента заражения, чтобы определить вирус с помощью выбранного теста. Это может быть связано с тем, что инкубационный период варьируется от у различных лиц, или с отсутствием информации о том, когда произошло воздействие. Чем раньше обнаружена инфекция, тем выше вероятность предотвращения дальнейшей передачи (например, путем мониторинга контактных лиц). Поэтому дальнейшее тестирование выполняется из-за риска получения отрицательного результата первого теста, если он выполняется на стадии заражения, когда вирус еще не может быть обнаружен с помощью данного теста, особенно если это экспресс-тест с более высоким пределом обнаружения.
Как показано на графике средней продолжительности контагиозности (см. рисунок), определяемой как процент возможных передач инфекции, примерно за 4 дня до появления симптомов наблюдается ее резкое увеличение, что увеличивает виремию и обнаружение вируса. 9,10 Однако обнаружено, что тест ОТ-ПЦР во время инкубационного периода может выявить вирусную РНК за 1–3 дня до появления симптомов. 9,11,12
Поскольку в подавляющем большинстве случаев инкубационный период составляет ≤12 дней (см. «Инкубационный период» выше), обычно от заражения до обнаружения вируса проходит несколько дней. Следовательно, у бессимптомных или предсимптомных людей, когда не известно, когда произошел контакт с патогеном или информация об этом недостоверна, проверка первого теста с отрицательным результатом в одном или нескольких последующих тестах может значительно повысить эффективность выявления инфицированных людей. Поскольку в большинстве случаев инкубационный период заболевания составляет 12 дней, а вирус обнаруживается за 1–3 дня до появления симптомов, мы оцениваем на основе имеющихся в настоящее время данных, что тест, проведенный примерно на 10-й день после возможного контакта с вирусом, позволяет выявить большинство случаев инфекции, вызванной SARS-CoV-2. ECDC постоянно анализирует данные по мере их поступления и проводит собственные модельные анализы в этом отношении, поэтому эта оценка может измениться по мере появления новой информации.
Типы образцов
Образцы для диагностического тестирования на наличие SARS-CoV-2 можно получить из верхних отделов (мазки из носоглотки или ротоглотки, назальный аспират, промывные воды из носа, слюна) или нижних дыхательных путей (мокрота, трахеальный аспират или бронхоальвеолярная лаважная жидкость). Сравнение точности тестов ОТ-ПЦР для этих материалов указывает на возможные различия в пределах количественного определения теста в зависимости от типа образца. Считается, что мазки из носоглотки и ротоглотки обеспечивают соответствующий предел количественного определения для тестирования SARS-CoV-2, причем было обнаружено, что тестирование с образцами материала и из носоглотки и из ротоглотки обеспечивает более высокий предел количественного определения, чем те, которые сделаны с использованием мазка только из носоглотки. 11,14,15 Если нельзя получить мазки из носоглотки или другой материал из верхних дыхательных путей (как указано выше), допускается забор слюны. 16, 17 Это происходит неинвазивным способом, поэтому можно рассмотреть возможность самостоятельного забора пациентом.
1. Li Q., Guan X., Wu P. и соавт.: Early transmission dynamics in Wuhan, China, of novel coronavirus-infected pneumonia. N. Engl. J. Med., 2020; 382: 1199–1207
2. Lauer S.A., Grantz K.H., Bi Q. и соавт.: The incubation period of coronavirus disease 2019 (COVID-19) from publicly reported confirmed cases: estimation and application. Ann. Intern. Med., 2020; 172: 577–582
3. World Health Organization (WHO): Laboratory testing for coronavirus disease (COVID-19) in suspected human cases: interim guidance. 19.03.2020. https://apps.who.int/iris/ handle/10665/331501
4. Kellam P., Barclay W.: The dynamics of humoral immune responses following SARS-CoV-2 infection and the potential for reinfection. J. Gen. Virol., 2020; 101: 791–797
5. European Commission (EC): 2002/364/EC: Commission Decision of 7 May 2002 on common technical specifications for in vitro-diagnostic medical devices (Text with EEA relevance) (notified under document number C(2002) 1344). 2002. https://eurlex.europa. eu/legal-content/EN/TXT/?uri=CELEX%3A32002D0364
6. WHO: COVID-19 Target product profiles for priority diagnostics to support response to the COVID-19 pandemic v.0.1. 5.08.2020. www.who.int/publications/m/item/covid-19-target-product-profiles-for-priority-diagnostics-to-support-response-to-the-covid-19-pandemic-v. 0.1
7. ECDC: Infection prevention and control and surveillance for coronavirus disease (COVID-19) in prisons in EU/EEA countries and the UK. 3.07.2020. www.ecdc.europa.eu/ en/publications-data/infection-prevention-and-control-and-surveillance-covid-19-prisons
8. Shental N., Levy S., Wuvshet V. и соавт.: Efficient high-throughput SARS-CoV-2 testing to detect asymptomatic carriers. Science Adv., 2020: eabc5961
9. He X., Lau E.H.Y., Wu P. и соавт.: Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nat. Med., 2020; 26: 672–675
10. He X., Lau E.H.Y., Wu P. и соавт.: Author correction: temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nat. Med., 2020; 26: 1491–1493
11. Pan Y., Zhang D., Yang P. и соавт.: Viral load of SARS-CoV-2 in clinical samples. Lancet Infect. Dis., 2020; 20: 411–412
12. Wei W.E., Li Z., Chiew C.J. и соавт.: Presymptomatic transmission of SARS-CoV-2 – Singapore, January 23–March 16, 2020. MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep., 2020; 69: 411–415
13. ECDC: Guidance for discharge and ending isolation In the context of widespread community transmission of COVID-19 – first update. 8.04.2020. www.ecdc.europa.eu/en/ publications-data/covid-19-guidance-discharge-and-ending-isolation
14. Yan Y., Chang L., Wang L.: Laboratory testing of SARS-CoV, MERS-CoV, and SARS-CoV-2 (2019-nCoV): current status, challenges, and countermeasures. Rev. Med. Virol., 2020; 30: e2106
15. Mawaddah A., Gendeh H.S., Lum S.G., Marina M.B.: Upper respiratory tract sampling in COVID-19. Malays J. Pathol., 2020; 42: 23–35
16. Yang Y., Yang M., Shen C. и соавт.: Evaluating the accuracy of different respiratory specimens in the laboratory diagnosis and monitoring the viral shedding of 2019-nCoV infections. medRxiv, 2020.02.11.20021493