Чем отличается морфология стафилококков на плотных и жидких питательных средах

Чем отличается морфология стафилококков на плотных и жидких питательных средах

Глава 14. Стафилококки

Впервые стафилококки были обнаружены Л. Пастером в 1897 г. Подробно они были изучены А. Огстоном (1882) и Ф. Розенбахом (1884).

Элективными средами являются желточно-солевой агар и солевой агар. На МПА колонии стафилококка выпуклые, круглые, непрозрачные, блестящие, размером 2-4 мм с ровными краями. При росте стафилококки образуют пигмент: золотистый, лимонно-желтый или белый. Лучше всего пигмент образуется на молочной среде при комнатной температуре и рассеянном свете. Стафилококковый пигмент не растворяется в воде, растворяется в ацетоне, эфире, спирте и т. д. При росте некоторых штаммов стафилококка на агаре с кровью вокруг колонии образуется зона гемолиза. Рост на бульоне характеризуется равномерным помутнением и осадком на дне.

Ферментативные свойства. Стафилококки вырабатывают сахаролитические и протеолитические ферменты. Сахаролитические ферменты расщепляют ряд сахаров: лактозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, глицерин и другие с образованием кислоты.

Протеолитические свойства стафилококка выражаются в способности растворять казеин, разжижать желатин (медленно), расщеплять другие белковые субстраты.

Стафилококки продуцируют ферменты патогенности: 1) коагулазу (сворачивает плазму крови); 2) гиалуронидазу (фактор распространения); 3) лецитиназу (растворяет лецитин оболочки клеток); 4) фибринолизин (лизирует фибрин); 5) ДНКазу (деполимеризует ДНК); 6) фосфатазу и др.

Наличие плазмокоагулазы позволяет дифференцировать золотистый стафилококк от стафилококков других видов. Многие стафилококки вырабатывают пенициллиназу, разрушающую пенициллин.

Кроме гемолизинов стафилококки образуют лейкоцидин, убивающий лейкоциты, энтеротоксины шести типов, вызывающие пищевые отравления, эксфолиатины двух типов, приводящие к отслаиванию эпидермиса у новорожденных детей.

Антигенная структура. Стафилококки имеют протеиновый антиген А, общий для всех золотистых стафилококков, и полисахаридные антигены: А, Б, С.

Стафилококки выделяют бактериоцины (стафилоцины), которые обладают антагонистическим действием по отношению к микроорганизмам данного рода.

Среди золотистых (реже эпидермальных) стафилокков различают около 40 фаговаров. Определение чувствительности выделенных из различных объектов стафилококковых культур к типовым фагам имеет важное эпидемиологическое значение (при установлении источника и путей передачи возбудителя).

Классификация. В настоящее время стафилококки, выделенные от человека, делят на 3 вида (табл. 23): S. aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus.

Таблица 23. Дифференциация видов стафилококков, выделенных от человека

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Контактно-бытовой, воздушно-капельный, воздушно-пылевой, пищевой.

Заболевания у человека. Пиодермия, фурункулы, карбункулы, панариции, абсцессы; воспалительные процессы различных органов и тканей; ангины, циститы, остеомиелиты, холециститы, маститы; сепсис и септикопиемия; пищевые токсикоинфекции и многие другие. Описано около 120 нозологических форм стафилококковой этиологии.

Патогенез. Стафилококки проникают через кожу и слизистые оболочки.

Особое место среди стафилококковых заболеваний занимают пищевые интоксикации. Клинически они протекают как токсикозы, сопровождаются рвотой, поносом, головной болью и другими явлениями.

Иммунитет. У человека имеется естественная резистентность, связанная с механическими факторами, фагоцитозом и наличием антител. Воспалительный процесс, возникающий в месте внедрения возбудителя, обусловливает задержку стафилококков и затрудняет их распространение по организму. В образовавшемся очаге стафилококки подвергаются фагоцитозу.

Образующийся в процессе заболевания антитоксин является важным фактором в общем комплексе иммунитета. Однако приобретенный иммунитет нестойкий, поэтому наблюдаются рецидивы.

Профилактика. Сводится к улучшению санитарно-гигиенических условий, активному выявлению больных и бактерионосителей, правильному режиму работы больничных учреждений.

Специфическая профилактика. Стафилококковый анатоксин и антистафилококковый иммуноглобулин.

Лечение. Антибактериальные препараты, поливалентный стафилококковый бактериофаг, антистафилококковая плазма и иммуноглобулин. В некоторых случаях при хроническом течении стафилококковых инфекций применяют аутовакцину.

Контрольные вопросы

1. По какому признаку кокки объединены в одну группу?

2. Какие ферменты и факторы патогенности продуцируют стафилококки?

3. Какие заболевания вызывают стафилококки?

4. Какие виды стафилококков Вы знаете?

Микробиологическое исследование

Цель исследования: выделение и идентификация стафилококков.

1. Гной (фурункулы, карбункулы, абсцессы).

2. Слизь из зева (ангина).

3. Мокрота (пневмония).

4. Моча (пиелиты и циститы).

5. Дуоденальное содержимое (холецистит).

6. Кровь (подозрение на сепсис).

7. Рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты (пищевые отравления).

8. Слизь из носа (обследование на бактерионосительство).

Способы сбора материала

Первый день исследования

Все посевы ставят в термостат на сутки.

Обнаружение стафилококков при микроскопии гноя из закрытого абсцесса и осадка мочи, взятой катетером, позволяет дать предварительный положительный ответ: обнаружен стафилококк.

Посевы на плотных и жидких питательных средах вынимают из термостата и изучают. Подозрительные в отношении стафилококка колонии, выросшие на желточно-солевом агаре, отсевают на скошенный агар для получения и дальнейшего изучения чистой культуры. При этом учитывают наличие лецитиназы, которое проявляется в образовании радужного венчика вокруг колонии. Чашки с оставшимися колониями оставляют на 2-3 дня при комнатной температуре для выявления пигмента. Просматривают посевы на чашках с агаром, содержащим кровь. Колонии с четкой зоной гемолиза (просветление) вокруг них выделяют на скошенный агар. Посев крови в сахарном бульоне инкубируют 10 сут, производя через 2-3 дня высевы на агар с кровью и желточно-солевую среду.

При отсутствии роста на плотных питательных средах делают высев из бульона с глюкозой на агар с кровью. Посевы ставят в термостат на сутки.

Вынимают посевы из термостата. Из выделенных на скошенный агар культур делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При наличии грамположительных стафилококков проводят дальнейшее изучение выделенной культуры:

а) ставят реакцию плазмокоагуляции;

б) изучают гемолитические свойства;

в) определяют продукцию ДНКазы;

г) определяют ферментацию маннита в анаэробных условиях;

д) определяют устойчивость к новобиоцину.

Реакция плазмокоагуляции. Цитратную плазму, полученную из крови кролика, разводят изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:4 и наливают в две преципитационные пробирки по 0,3-0,5 мл. В одну пробирку вносят петлю исследуемой культуры, другая пробирка служит контролем. Обе пробирки ставят в термостат при температуре 37° С. Учет реакции производят через 2-3 ч. При отсутствии свертывания плазмы посевы оставляют при комнатной температуре на 24 ч, после чего учитывают реакцию. При наличии фермента коагулазы плазма свертывается (не выливается из перевернутой пробирки). В контрольной пробирке консистенция плазмы не изменяется.

Ускоренный метод определения коагулазы. В стерильной капле воды на предметном стекле суспендируют выделенную культуру, к ней прибавляют одну каплю неразведенной плазмы. При положительной реакции из микробных клеток в течение 20-60 с образуются крупные хлопья. Этот метод используют при массовых обследованиях.

Определение гемолитических свойств. Производят посев на агар с 5% крови (штаммы, продуцирующие α-гемолизин, дают зоны просветления среды и на кроличьей и на бараньей крови, продуцирующие β-гемолизин лизируют только эритроциты барана).

Определение ДНКазы. Исследуемую культуру засевают на среду, содержащую ДНК. Посевы инкубируют. Через 18-20 ч на чашку с выросшими колониями стафилококка добавляют 5-7 мл раствора хлороводородной кислоты. ДНК реагирует с кислотой и среда становится мутной. Если выделенная культура продуцирует фермент ДНКазу, он деполимеризует ДНК и помутнение не образуется.

Расщепление маннита в анаэробных условиях. Исследуемую культуру засевают уколом на полужидкий агар с маннитом. Поверхность среды заливают вазелиновым маслом. Инкубируют 18-24 ч при 37° С. Положительная реакция характеризуется изменением цвета среды (в среде имеется индикатор).

Производят учет результатов (табл. 24).

Таблица 24. Свойства золотистого стафилококка

Примечание. + положительная реакция.

Наличие перечисленных признаков позволяет отдифференцировать золотистые стафилококки от стафилококков других видов и дать окончательный ответ: выделен S. aureus (рис. 37).

Рис. 37. Схема выделения и идентификации стафилококка

Для установления эпидемиологической цепочки выделенную культуру фаготипируют. Фаготипирование может подтвердить идентичность стафилококков, выделенных от разных больных и из объектов внешней среды.

Для фаготипирования используют критические тест-разведения фагов. Критическим тест-разведением называют то максимальное разведение фагов, при котором происходит полусливной лизис соответствующего штамма стафилококка.

Методика фаготипирования. В чашку Петри наливают 20 мл 1,5% МПА, дают ему застыть и подсушивают в термостате в течение 30-40 мин. На поверхность агара наносят 1 мл 4-6-часовой культуры выделенного стафилококка, распределяют по поверхности всей чашки, избыток жидкости отсасывают или дают ей испариться в термостате в открытой чашке. Предварительно дно чашки делят на секторы или квадраты. Число квадратов или секторов должно соответствовать количеству используемых фагов. Затем на каждый квадрат или сектор наносят один фаг.

Чашки ставят в термостат при температуре 37° С. Результаты определяют через 6-7 ч. Если чашки оставляют при комнатной температуре, то учет фаголизиса производят через 18-24 ч.

Биологические пробы. Проба на определение летальных свойств культуры. Для выявления летального действия токсина кролику вводят внутривенно (или внутрибрюшинно) фильтрат бульонной культуры стафилококка из расчета 0,1-0,2 мл фильтрата на 1 кг массы кролика. Гибель кролика через 3-4 дня свидетельствует о наличии летального действия токсина.

Дермонекротическая проба. Пробу ставят на кролике (наиболее чувствительному к этому токсину животному). Предварительно на боку или на спине животного выщипывают шерсть и вводят внутрикожно 0,2 мл двухмиллиардной взвеси стафилококковой культуры в изотоническом растворе натрия хлорида. При наличии в выделенной культуре некротических свойств в месте введения образуется инфильтрат, сопровождающийся некрозом.

Реакцию учитывают через 24-18 ч.

Полученную культуру стафилококка проверяют на чувствительность к антибиотикам методом бумажных дисков (см. главу 9).

Контрольные вопросы

1. Какой материал исследуют при заболеваниях, вызываемых стафилококками?

2. Каковы основные методы лабораторного исследования для выявления стафилококков?

3. Какова методика постановки реакции плазмокоагуляции?

4. На какой среде выявляют гемолитические свойства стафилококков?

5. С какой целью проводят фаготипирование?

Задание

Проверьте, к какому антибиотику чувствительна выделенная культура стафилококка.

Желточно-солевой агар Чистовича. Готовят желточную смесь (1 желток куриного яйца на 150 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида). К мясопептонному солевому агару (8-10% натрия хлорида), растопленному и остуженному до 45° С, добавляют 20% желточной взвеси (соблюдают стерильность) и разливают в чашки.

Агар с кровью. См. главу 7.

Источник

Стафилококк золотистый. Микробиологические аспекты

Прошло много лет после написания первой статьи, посвященной лечению инфекций, вызванных золотистым стафилококком. За это время автор, будем надеяться, немного помудрела и приобрела кое-какой опыт в более детальной диагностике вышеупомянутых состояний, чем и хотела бы поделиться с многоуважаемой аудиторией в надежде, что, возможно, поможет каждому из вас в рутинной ежедневной работе, так как с этой зверюшкой сталкивается буквально каждый, кто надел белый халат и уж тем более хирургический костюм.

Автор: Трубачева Е.С., врач – клинический фармаколог

Прошло много лет после написания первой статьи, посвященной лечению инфекций, вызванных золотистым стафилококком. За это время автор, будем надеяться, немного помудрела и приобрела кое-какой опыт в более детальной диагностике вышеупомянутых состояний, чем и хотела бы поделиться с многоуважаемой аудиторией в надежде, что, возможно, поможет каждому из вас в рутинной ежедневной работе, так как с этой зверюшкой сталкивается буквально каждый, кто надел белый халат и уж тем более хирургический костюм.

Сначала повторим общеизвестные факты: S.aureus относится к грамположительным коккам и являются чуть ли не основной причиной большого количества инфекций кожи и мягких тканей, а так же ведущей причиной послеоперационных раневых инфекций.

Выделяют следующие разновидности золотистого стафилококка:

И сейчас обсудим первые три более подробно, так как именно они являются той причиной, ради которой повторно поднята данная тема, в том числе и по просьбам читателей (за что выражаем отдельную признательность).

Первое, что необходимо не просто запомнить, а буквально зазубрить наизусть — золотистый стафилококк, он же S.aureus, является нормальным жителем на неповрежденной коже и слизистых оболочках. Еще раз — нормальным, но только на неповрежденной коже и вне зависимости от антибиотикочувствительности пойманных экземпляров. Если кожа по тем или иным причинам поражается (например, сахарным диабетом) или повреждается, стафилококк тут же из милого соседа превращается в злейшего врага. Все как у людей — стоит дать слабину, и ближайшие соседи начнут добивать с ласковой улыбкой.

Таким образом, когда вы получаете результат микробиологического исследования образца, взятого с кожи (или из носоглотки), и видите там золотистого стафа, то должны понимать, кто перед вами, и насколько этот кто-то имеет отношение к текущему процессу.

Второе: если клиника отсутствует, а стафилококк посеялся, надо сделать что? Правильно, повторить посев еще раз. Золотистый стафилококк — это один из немногих микробов, чье наличие в отделяемом материале надо проверять дважды. Единственное исключение — это кровь, взятая непосредственно из сосудистого русла, чаще всего из вены. Наличие стафилококка в крови является поводом к немедленному назначению антибактериальной терапии, так как прямо указывает на наличие инфекции кровотока, а уж какого она генеза, спонтанного или ятрогенного, разбираться будете позже. Во всех остальных ситуациях проводится пересев с тщательным соблюдением техники забора материала (со стенок раны, а не гной, состоящий из дохлых нейтрофилов и нападавших сверху стафилококков) и правил асептики и антисептики, чтобы собственными стафилококками с кожи вновь забранный материал не контаминировать.

Чтобы понять, друг перед нами или враг, познакомимся со стафилококками более подробно.

И нет, автор не сошла с ума — резистентность к ванкомицину у природных диких золотистых стафилококков — совершенно нормальное явление. Более того, попытка лечить такого возбудителя ванкомицином считается грубейшей ошибкой и закончится полным провалом в силу природной устойчивости к данному препарату. Это третье, о чем помнить необходимо.

Где мы встречаем таких S.aureus чаще всего? В носоглотках грудных младенцев или в их же кале, если придумали посеять. Почему? Потому что это представитель нормальной микрофлоры кожи, и ребенок сглатывает то, что живет в его носоглотке или слизывает с кожи матери. Надо лечить? В данной ситуации — ни в коем случае, иначе побьете нормальную микрофлору кожи и слизистых, и если очень повезет, то для ребенка это пройдет без последствий, но, скорее всего, получим стафилококка, вооруженного пенициллиназами, или MSSA. Повторимся еще раз — только в случае отсутствия клинической картины можно принимать такого рода решения. Во всех иных случаях необходима антибактериальная терапия, причем на длительный (до 28 суток) период времени.

Обратите внимание на строку с бензилпенициллином, указывающую на наличие пенициллиназ. Мы обязаны упомянуть, что точно такая же картинка может наблюдаться и у пациентов, давно или никогда не применявших антибиотики, так как пенициллиназы еще в середине прошлого века «ушли» в дикую природу.
Почему MSSA? Обратите внимание на строку с оксациллином, который в данной панели поставлен вместо метициллина. Таким же ориентиром может быть цефазолин. Оба этих препарата до сих пор являются самыми эффективными в клиническом плане антибиотиками для эрадикации дикого и MSSA стафилококков, если к этому имеются показания

При каких состояниях мы можем увидеть подобных возбудителей?

Типичным для клинической картины будет довольно агрессивное течение заболевания с яркими клиническими проявлениями ввиду того, что именно такой вид стафилококка обладает определенным набором ферментов, очень быстро расплавляющим окружающие ткани с образованием полостей и большим количеством гнойного отделяемого.

на антибиотикограмме будет выглядеть приблизительно так, оксациллин-резистентный, но ванкомицин-чувствительный (хотя при таком значении МПК уже возможны варианты)

Когда встречается? Все многообразие ятрогенных ВБИ к вашим услугам — почти все раневые инфекции и послеоперационные гнойные осложнения вне зависимости от их локализации. Повторимся в очередной раз — руки надо мыть, и мыть правильно. А еще закрывать маской не только рот, но и нос всем, кто хоть как-то касается открытых ран вне зависимости от причин их образования, так как стоит ране появиться, как стафилококк мгновенно превращается в зверя, осложняющего течение любого послеоперационного периода, особенно после операций, связанных с установками импланта. Более подробно о лечении предлагаем почитать в первой статье.

А теперь, тихо-тихо прошепчем, что иногда так может выглядеть приболевший микробиологический анализатор, который все, что в него не поставят, может определять как подобную страшную зверюгу. Хотя у вашего анализатора может быть какая-то своя болячка, и эти болячки лучше все-таки знать. Именно такого рода антибиотикограммы, как ничто другое наглядно показывают необходимость развития клинического мышления для умения отличать истинного возбудителя от контаминанта или нормального жителя человеческого организма, а также необходимости понимания, как работают методы микробиологической диагностики и варианты их ограничения.

Подведем краткие итоги нынешнего разговора:

В заключение хотелось бы отметить следующее. Уважаемые коллеги, золотистый стафилококк, при отсутствии клинической картины и на неповрежденной коже и слизистых является нормой — не надо его там «лечить». И брызгать ничем туда не надо. А в случаях наличия клинической картины (исключение — инфекции кровотока), необходимо провести повторный посев, с тщательным соблюдением правил асептики и антисептики, чтобы быть уверенными, что именно этот микроб является возбудителем, а не кто-то прячется за его спиной.

Источник

Чем отличается морфология стафилококков на плотных и жидких питательных средах

Микроскопия золотистого стафилококка. Выявление скоплений грамположительных кокков и полиморфно-нуклеар-ных лейкоцитов при исследовании окрашенных мазков клинического материала может служить основанием для предварительного диагноза. Следует помнить, что результаты микроскопии нельзя считать достаточными для выдачи окончательного заключения.

Выделение золотистого стафилококка

Посев золотистого стафилококка проводят на простые питательные среды, обычно на тио-гликолевую среду и КА. Если существует риск контаминации образца, применяют дифференциально-диагностические среды. Наиболее часто используют молочно-солевой (или молочно-жел-точно-солевой) агар и солевой агар с маннитом, на них рост контаминирующей микрофлоры угнетает высокая концентрация NaCl. Кроме того, на молочно-солевом агаре (МСА) хорошо проявляется способность к пигментообразованию и разложению лецитина (лецитовителазная активность). В последнее время широкое распространение в качестве дифференциально-диагностической среды нашёл агар с колистином и налидиксовой кислотой.

Через 18-24 ч золотистый стафилококк ( S. aureus ) образует гладкие выпуклые мутные колонии диаметром около 4 мм. Бактерии синтезируют жёлтый пигмент, цвет колоний варьирует от белого до оранжевого. На КА колонии S. aureus окружены зоной полного гемолиза (рис. 1, см. цветную вклейку).

Стафилококки хорошо растут на бульоне, сначала вызывая его равномерное помутнение, а затем образуя рыхлый хлопьевидный осадок. Они дают весьма характерный рост в желатине; через 24-28 ч (наряду с обильным ростом по ходу укола микробиологической иглы) наблюдают начальное разжижение среды, а на 4-5-е сутки образуется открытая вниз воронка, заполненная разжиженной средой.

Для внутривидовой дифференцировки золотистого стафилококка ( S. aureus ) применяют коагулазный тест (на наличие свёртывающего фактора), положительный у 95% изолятов (рис. 12-3). Существует ещё несколько дифференцирующих признаков.

• Способность ферментировать маннит в анаэробных условиях.
• Лецитовителазная активность — образование перламутрового преципитата-«венчика», окружающего колонии, выросшие на средах с добавлением яичного желтка. Преципитат состоит из фосфорилхолина, образующегося из лецитина яичного желтка под действием фермента.
• Способность синтезировать термостабильную ДНКазу.
• Способность агглютинировать сенсибилизированные эритроциты барана (последний тест позволяет выявить белок А, свёртывающий фактор либо оба продукта).

Для экспресс-идентификации золотистого стафилококка ( S. aureus ) применяют тест латекс-агглютинации с использованием коммерческих наборов частиц латекса, нагруженных AT, например «Staphylatex» (American Microscan).

Источник