Чем обусловлены цветные реакции на аминокислоты и белки

Цветные реакции на белки и аминокислоты

НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ. В этой реакции растворы белка, полипептидов, пептидов и свободных α-аминокислот при нагревании с нингидрином дают синее, сине-фиолетовое или розово-фиолетовое окрашивание. Окраска в этой реакции развивается за счет α-аминогруппы. Реакция протекает в две стадии.

Нингидрин образует с аминокислотами соединения с двойной связью между углеродом и азотом, называемые иминами или основаниями Шиффа.

Альдимин Промежуточный амин Альдегид

Эти соединения обладают высокой реакционной способностью. Дальнейшее превращение их приводит к промежуточному амину, который может реагировать со второй молекулой нингидрина, давая соединение окрашенное в сине-фиолетовый (пурпурный) цвет – сине-фиолетовый (пурпурный) Руэмана.

Очень легко реагируют с нингидрином a-аминокислоты. Наряду с ними сине-фиолетовый Руэмана образуют также белки, пептиды, первичные амины, аммиак и некоторые другие соединения. Вторичные амины, например пролин и оксипролин, дают желтую окраску.

Нингидриновую реакцию широко используют для обнаружения и количественного определения аминокислот.

ХОД РАБОТЫ. Берут пять пробирок, и вносят по 1 мл: в первую воды, во вторую – раствора казеина, в третью – раствора яичного белка, в четвертую – раствора желатины, в пятую – раствора аминокислоты (глицина). Затем в каждую пробирку добавляют по 10-12 капель раствора с массовой долей нингидрина в ацетоне или этаноле 1 %. Содержимое каждой пробирки перемешивают встряхиванием и ставят их в кипящую водяную баню на 3-5 мин. Записывают химизм реакции, схему постановки опыта, строение окрашенных соединений. Результаты вносят в табл. 1.

КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ. Эта реакция указывает на наличие в белках остатков ароматических аминокислот – тирозина, фенилаланина, триптофана. Основана на нитровании бензольного кольца радикалов этих аминокислот с образованием нитросоединений, окрашенных в желтый цвет (греческое «Ксантос» – желтый). На примере тирозина эту реакцию можно описать в виде следующих уравнений.

Тирозин Нитротирозин

Нитротирозин Натриевая соль нитротирозина

В щелочной среде нитропроизводные аминокислот образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет.

Ксантопротеиновую реакцию дают бензол и его гомологи, фенол и другие ароматические соединения.

ХОД РАБОТЫ. Берут четыре пробирки и вносят по 1 мл: в первую раствора казеина, во вторую – раствора яичного белка, в третью – раствора желатины, в четвертую – раствора фенола. Во все пробирки добавляют по 10 капель концентрированной азотной кислоты. Содержимое перемешивают встряхиванием и пробирки помещают в кипящую водяную баню на 5-8 мин. Под действием кислоты появляется осадок белка, который при нагревании окрашивается в желтый цвет. После бани пробирки выдерживают при комнатной температуре 4-5 мин и записывают окраску содержимого. Затем в каждую пробирку прибавляют по 1 мл раствора с массовой долей гидроксида натрия 30 % (или другую щелочь). Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, окраску записывают. Работу оформляют в соответствии с табл.1.

РЕАКЦИЯ ФОЛЯ (на слабосвязанную серу). Этой реакцией открывают в белках радикалы цистеина содержащие как свободные –SH (тиоловые) радикальные группы, так и окисленные с образованием дисульфидных (-S-S-) связей цистина.

При нагревании белка, содержащегося в молекуле остатки цистеина и цистина, с концентрированным раствором щелочи и ацетатом (или другой растворимой солью) свинца (реактив Фоля) образуется бурое или черное окрашивание. Это объясняют тем, что под действием щелочи от радикалов цистеина отщепляется сера в виде иона со степенью окисления минус два, который, взаимодействуя с ионом свинца (II), дает бурый или черный нерастворимый осадок сульфида свинца. Белки, в составе которых нет цистина и цистеина, реакцию Фоля не дают. Химизм процесса можно описать следующими реакциями:

Ацетат свинца Ацетат натрия

При нагревании со щелочью часть белка подвергается гидролизу. Кроме того происходит отщепление части аминогрупп (реакция дезаминирования) в виде аммиака, который можно обнаружить по запаху и посредством смоченной водой красной лакмусовой бумажки, поднесенной к отверстию пробирки (не касаться стенок!).

ХОД РАБОТЫ. Берут четыре пробирки и вносят по 1 мл: в первую воды, во вторую – раствора казеина, в третью – раствора яичного белка, в четвертую – раствора желатины. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора с массовой долей гидроксида натрия 30 % и по 6-8 капель раствора с массовой долей ацетата свинца 5 %, или можно приготовить реактив Фоля на всю подгруппу и добавить по 1 мл в каждую пробирку приготовленного раствора. Содержимое перемешивают встряхиванием, и пробирки помещают в кипящую водяную баню на 5-7 мин. Окраску содержимого пробирок записывают. Результаты оформляют в табл. 1.

РЕАКТИВЫ.Вода дистиллированная (в дальнейшем вода); растворы с массовыми долями: казеина 1 %, желатины 1 %, яичного белка 1 %, сульфата меди 1 %, гидроксида натря 10 и 30 %, глицина (или другой аминокислоты) 0,1 %, фенола 0,1 %, ацетата свинца 5 %, нингидрина в ацетоне или этаноле 1 %; концентрированная азотная кислота.

Реактив Фоля готовят в пробирке перед определением. В пробирку вносят 1 мл 5 % раствора ацетата свинца и небольшими порциями (по 1,5-2 мл) приливают 30 % раствор гидроксида натрия с интервалом 30 сек, каждый раз, перемешивая, до растворения молочно-белого хлопьевидного осадка появившегося после внесения первой порции гидроксида натрия.

1. Общая характеристика пептидов, полипептидов, белков и их строения.

2. Как соединяются аминокислоты в молекуле белка и за счет каких групп? Соедините Ала, Цис, Сер.

3. Перечислите цветные реакции на белки и аминокислоты.

4. Какая реакция открывает пептидные связи? Её химизм.

5. Что характеризуют цвет и интенсивность окраски при положительной биуретовой реакции?

6. Что открывает нингидриновая реакция? Её химизм.

7. Назовите аминокислоты имеющие в радикале бензольное кольцо. Какой реакцией можно обнаружить ароматические аминокислоты? Её химизм.

8. Назовите аминокислоты содержащие серу. Какую из них обнаруживает реакция Фоля? Химизм реакции.

9. Какую цветную реакцию используют для количественного определения белков в растворе и почему?

10. Какую цветную реакцию используют для количественного определения α-аминокислот и почему?

Источник

Лабораторная работа №1

Лабораторная работа №1

ХИМИЯ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ.

ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ

Белки представляют собой высокомолекулярные полимерные органические соединения, построенные из остатков различных α-аминокислот, соединенных ковалентной пептидной связью.

Присутствие белка в растворах можно обнаружить с помощью цветных реакций, обусловленных наличием в белке аминокислот, их специфических групп и пептидных связей. Существуют универсальные цветные реакции, т. е. на все белки (биуретовая и нингидриновая), и специфические, т. е. на определенные аминокислоты (ксантопротеиновая, Миллона, Фоля и др.).

На основании некоторых цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот, которые широко используются в биохимических лабораториях.

Цель: Ознакомиться с универсальными цветными реакциями на белки и специфическими реакциями на отдельные аминокислоты, содержащиеся в белковых растворах.

Работа 1. Биуретовая реакция на пептидную связь (Пиотровского)

Биуретовая реакция обусловлена наличием в белке пептидных связей, которые в щелочной среде образуют с сернокислой медью комплексы фиолетового цвета с красным или синим оттенком. Группа, образующая пептидную связь, в щелочной среде присутствует в своей таутомерной енольной форме:

При избытке щелочи происходит диссоциация ОН-группы, появляется отрицательный заряд, с помощью которого кислород взаимодействует с медью. Возникает солеобразная связь. Кроме того, медь образует дополнительные координационные связи с атомами азота, участвующими в пептидной связи, путем использования их электронных пар. Возникающий таким образом комплекс очень стабилен. Интенсивность окраски комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе.

Исследуемый материал: раствор яичного белка, раствор растительного белка, 1% раствор желатина.

Реактивы: 10% раствор NaOH, 1% раствор CuSO4.

Оборудование: пробирки, капельницы.

Ход работы. К 5 каплям водного раствора белка добавляют 5 капель 10% раствора NaOH и 2 капли 1% раствора CuSO4. Содержимое перемешивают. Оно приобретает сине-фиолетовый цвет. Нельзя добавлять избыток CuSO4, так как синий осадок маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса.

Работа 2. Нингидриновая реакция на α-аминокислоты

Белки, полипептиды и свободные α-аминокислоты дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином. При нагревании белка с водным раствором нингидрина аминокислоты окисляются и распадаются, образуя СО2, NH3 и соответствующий альдегид. Нингидрин, являясь сильным окислителем, вызывает окислительное дезаминирование α-аминокислоты, приводящее к образованию аммиака, двуокиси углерода, соответствующего альдегида и восстановленной формы нингидрина. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации, окрашенные в синий, фиолетовый, красный, а в случае пролина – в желтый цвет.

Источник

Цветные реакции

КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ

Цель работы:изучить качественные реакции, используемые для обнаружения белков и определения их аминокислотного состава

Цветные реакции

Для обнаружения белка применяют цветные реакции, которые делят на два типа: общие или универсальные и специфические. К универсальным реакциям относятся биуретовая (на пептидную связь) и нингидрировая (на α-аминокислоты). С их помощью можно обнаружить любой белок. К специфическим относятся реакции на отдельные аминокислоты, которые позволяют обнаружить специфические функциональные группы в составе радикалов аминокислот.Цветные реакции на белки лежат в основе методов установления белковой природы веществ, изучения аминокислотного состава и количественного содержания белков.

Работа 1. Биуретовая реакция (реакция Пиотровского).

В щелочной среде белки, а также продукты их гидролиза (полипептиды) дают фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание с сульфатом меди. Реакция обусловлена присутствием в балках пептидных связей, которые образуют окрашенные солеобразные комплексные соединения. Интенсивность окраски зависит от количества пептидных связей в молекуле и количества медной соли.

Свое название реакция получила от производного мочевины – биурета, который дает эту реакцию. Биурет образуется при нагревания мочевины с отщеплением от нее аммиака:

Две молекулы диенольной формы биурета взаимодействуют с образующимся в щелочной среде гидроксидом меди (II). Продуктом реакции является комплексное соединение (окрашенная медно-натриевая соль биурета), в котором координационные связи образованы за счет электронных пар атомов азота иминных групп:

Подобным образом построены окрашенные медно-натриевые соли пептидов и белков.

Биуретовую реакцию дает также аспарагин (амид аспарагиновой кислоты) и аминокислоты гистидин, серии, треонин.

Ход работы. В одну пробирку наливают 10-12 капель раствора яичного или растительного белка, в другую насыпают 20-30 мг мочевины и нагревают на спиртовке до исчезновения запаха аммиака и охлаждают. В обе пробирки добавляют по 10 капель 10-процентного раствора гидроксида натрия и по 1-2 капли 1-процентного раствора сульфата меди (II). В обеих пробирках появляется сине-фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание.

Работа 2. Нингидриновая реакция.

Белки, полипептиды и аминокислоты при нагревании с нингидрином дают синее и сине-фиолетовое окрашивание. Нингидриноваяреакция обусловлена наличием α-аминокислот и является одной из наиболее чувствительных для обнаружения α-аминогрупп.

Сущность реакции заключается в том, что α-аминокислоты и пептиды, реагируя с нингидрином, подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию:

Восстановленный нингидрин взаимодействует с аммиаком и второй молекулой нингидрина, в результате чего образуется сложное окрашенное соединение мурексидного строения:

Ход работы. В две пробирки наливают: в одну 10 капель раствора яичного или растительного белка, в другую 10 капель 0,1-процентного раствора глицина. В каждую из них добавляют по 2-3 капли 0,1-процентного раствора нингидрина и нагревают. Через 1-2 мин появляется розовое, затем красное, а затем синее окрашивание.

Работа 3. Ксантопротеиновая реакция (реакция Мульдера)

При нагревании растворов большинства белков с концентрированной азотной кислотой образуется желтое окрашивание, переходящее в щелочном растворе в оранжевое.

Реакция обусловлена присутствием циклических аминокислот, которые при взаимодействии с азотной кислотой образуют нитропроизводные желтого цвета, например:

Продукты нитрования циклических аминокислот, реагируя с едким натром или гидроксидом аммония, образуют соответствующие соли, имеющие оранжевую окраску:

Ход работы. В пробирку наливают 8-10 капель яичного или растительного белка, добавляют З-5 капель концентрированной азотной кислоты и нагревают. В пробирке появляется желтое окрашивание. После охлаждения к смеси добавляют избыток концентрированного раствора аммиака или 30-процентного раствора гидроксида натрия. Желтая окраска переходит в оранжевую.

Работа 4. Реакция на тирозин (реакция Миллона)

Нагревание большинства белков с реактивом Миллона (раствор нитратов и нитритов ртути (I) и (II) в азотной кислоте) приводит к образованию красного осадка.

Реакция обусловлена присутствием в белке аминокислоты тирозина, которая при взаимодействии с реактивом Миллона дает нитрозопроизводное, ртутное соединение которого окрашено в красный цвет:

Ход работы.К 8-10 каплям раствора белка добавляют 2-3 капли реактиваМиллона и осторожно нагревают. Жидкость окрашивается в красный цвет и выпадает красно-коричневый осадок.

Работа 5. Диазореакция на гистидин и тирозин (реакция Паули)

При добавлении к щелочному раствору белка диазореактива жидкость приобретает оранжево-красное окрашивание.

Реакция обусловлена присутствием в белке аминокислот гистидина и тирозина, которые, реагируя с диазобензолсульфокислотой,образуют азокраситель красного цвета:

Ход работы.К свежеприготовленномудиазореактиву (3 капли 1-процентного раствора сульфаниловой кислоты в 2-процентном растворе соляной кислоты и 3 капли 5-процентного раствора нитрита натрия) добавляют 6-8 капель раствора белка и после перемешивания 3-5 капель 10-процентного раствора карбоната натрия. Развивается интенсивная красная окраска.

Работа 6. Реакции на триптофан

Реакции основаны на способности триптофана в кислой среде вступать во взаимодействие с альдегидами, образуя при этом окрашенные продукты конденсации.

а) Реакция Адамкевича. Взаимодействие триптофана с глиоксиловой кислотой (которая всегда присутствует в ледяной уксусной кислоте) приводит к образованию соединения красно-фиолетового цвета:

Ход работы. К 5-6 каплям раствора белка добавить 5 капель концентрированной уксусной кислоты, слегка подогреть и подслоить (осторожно. по стенке наклоненной пробирки) равный объем концентрированной серной кислота. На границе двух слоев жидкости появляется красно-фиолетовое кольцо.

б) Реакция Шульца-Распайля. Триптофан, взаимодействуя с оксиметилфурфуролом (образующимся при гидролизе сахарозы и обезвоживании моносахаридов под действием концентрированной серной кислоты) образует комплекс вишнево-красного цвета.

Ход работы.К 5-6 каплям раствора белка приливают 1 каплю 10- процентного раствора сахарозы и подслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе раздела жидкостей появляется вишнево-красное окрашивание.

Работа 7. Реакция Фоля на содержащие серу аминокислоты

Нагревание белка со щелочью и плюмбитом приводит к появлению бурого или черного осадка. Реакция обусловлена наличием в белке содержащих серу аминокислот, которые под действием щелочи разрушаются с образованием сульфида щелочного металла; последний с плюмбитом дает осадок сульфида свинца:

Ход работы.К 5-6 каплям раствора белка добавляют 10 капель 30-процентного раствора гидроксида натрия и 1каплю 5-процентного раствора ацетата свинца. При длительном нагревании выпадает черный осадок сульфида свинца.

Источник

Чем обусловлены цветные реакции на аминокислоты и белки

Присутствие белков в биологических объектах или растворах можно определить с помощью цветных реакций, протекание которых обусловлено наличием в белке специфических групп и пептидных связей.

Реактивы: водный раствор яичного белка (белок одного куриного яйца отделяют от желтка, растворяют в 15–20-кратном объеме дистиллированной воды, затем раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3–4 слоя, и хранят в холодильнике;10 %-й раствор гидроксида натрия; 30 %-й раствор гидроксида натрия; 1 %-ный раствор сульфата меди; 1 %-й раствор ацетата свинца; концентрированная азотная кислота; 0,5 %-й раствор нингидрина.

Оборудование: пробирки; водяная баня или спиртовка.

Задание 1. Биуретовая реакция.

В щелочной среде белки, а также продукты их гидролиза – пептиды дают фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание с солями меди. Реакция обязана наличию пептидных связей в белках:

Интенсивность окраски зависит от длины полипептида.

Ход работы

Задание 2. Ксантопротеиновая реакция.

Реакция характерна для некоторых ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана), а также для пептидов, их содержащих. При действии азотной кислоты образуется нитросоединение желтого цвета. Далее нитропроизводные могут реагировать со щелочью с образованием натриевой соли, имеющей желто-оранжевое окрашивание:

Ход работы

Данную работу необходимо выполнять в вытяжном шкафу, соблюдая особую осторожность!

Задание 3. Реакция на серусодержащие аминокислоты (реак ция Фоля).

В остатках серусодержащих аминокислот цистеина и цистина сера при щелочном гидролизе отщепляется, образуя сульфиды. Сульфиды, взаимодействуя с ацетатом свинца, образуют осадок сульфида свинца черного или буро-черного цвета.

Ход работы

Задание 4. Нингидриновая реакция.

Реакция характерна для аминогрупп в α-положении и обусловлена наличием α-аминокислот в молекуле белка. При нагревании белка с водным раствором нингидрина аминокислоты окисляются и распадаются, образуя двуокись углерода, аммиак и соответствующий альдегид. Восстановленный нингидрин конденсируется с аммиаком и окисленной молекулой нингидрина, образуя соединение фиолетово-синего цвета:

Ход работы

В пробирку вносят 5 капель 1 %–го раствора яичного белка, добавляют по 3 капли 0,5 %-го раствора нингидрина и нагревают до кипения. Через 2–3 минуты появляется розовое, красное, а затем сине-фиолетовое окрашивание.

Оформление результатов

Оформите проведенные исследования в виде таблицы.

Источник

РАБОТА 1. Цветные реакции на белки и аминокислоты

ПМ 03 «Проведение лабораторных биохимических исследований»

Тема: «Свойства белков. Качественные реакции на белки и аминокислоты»

Учебные вопросы для самоподготовки студентов

1. Классификация белков (простые и сложные белки).

2. Характеристика простых белков (альбумины и глобулины, проламины и глютелины, протамины и гистоны, протеиноиды).

3. Нуклеопротеины. Строение ДНК, локализация, биологическая роль. Строение РНК, типы РНК (м-РНК, т-РНК, р-РНК), биологическая роль.

4. Характеристика липопротеинов. Особенности строения свободных липопротеинов плазмы крови, схема строения липопротеидной частицы. Классификация липопротеинов плазмы крови, место образования, биологическая роль.

5. Характеристика гликопротеинов. Особенности строения протеогликанов; классификация гликозаминогликанов., распространение в организме, биологическая роль.

6. Хромопротеины, классификация. Строение гемоглобина (Hb). Производные гемоглобина (окси-, карбокси-, карб- и метгемоглобин). Типы гемоглобина (эмбриональные Нb, HbA, HbF, HbS и др.). Ферментные гемопротеины, особенности функционирования, биологическая роль каталазы, пероксидазы и цитохромов.

На занятии студенты пишут обучающий тест.

На занятии студенты выполняют лабораторную работу: 1) цветные реакции на белки и аминокислоты; 2) качественные реакции на индикан и фенилпировиноградную кислоту.

Формулы, необходимые для запоминания:

· Азотистые основания: аденин, гуанин, урацил, тимин, цитозин.

· Схема строения мононуклеотида.

· Дисахаридные единицы гиалуроновой кислоты и хондроитин-4-сульфата.

Cпециальность 0407 «Лабораторная диагностика».

ПМ 03 «Проведение лабораторных биохимических исследований»

ЗАНЯТИЕ № 4: «Свойства белков. Качественные реакции на белки и аминокислоты»

Методические указания для выполнения самостоятельной лабораторной работы студентами.

РАБОТА 1. Цветные реакции на белки и аминокислоты.

Теоретическая часть. Цветные реакции лежат в основе качественных проб, полуколичественных и количественных методов определения белков, аминокислот и продуктов их обмена в биологических жидкостях.

Практическая часть.Провести цветные реакции на белки и аминокислоты, оформить протокол:

2. Название реакции.

4. Результаты записать в таблицу:

1.1. Биуретовая реакция на белки и пептиды. Принцип: в щелочной среде раствор белка при добавлении разбавленного раствора сульфата меди окрашивается в сине-фиолетовый цвет; окраска обусловлена образованием комплексов ионов меди с пептидными группами белка; биуретовую реакцию дают все белки, а также олигопептиды, содержащие не менее двух пептидных связей. Ход работы.К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка вносят 3 капли 10%-го раствора NaOH и 1 каплю 1%-го раствора CuSO₄. Наблюдают образование сине-фиолетового окрашивания.

1.3. Ксантопротеиновая реакция на ароматические аминокислоты (тирозин, фенилаланин, триптофан). Принцип:при нагревании с концентрированной азотной кислотой растворы белка дают желтое окрашивание; реакция обусловлена наличием в белках ароматических аминокислот и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот.

Ход работы. К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка добавляют 3 капли кон-центрированной HNO₃ и нагревают (осторожно!) в горячей водяной бане; появ-ляется осадок желтого цвета, пробирку охлаждают и добавляют 10 капель 10% NaOH – появляется оранжевое окрашивание.

1.3. Реакция Адамкевича на триптофан.Принцип: триптофан в кислой среде вступает в реакцию с глиоксиловой кислотой (альдегидами), образуя при этом окрашенные в красно-фиолетовый цвет продукты конденсации. Ход работы. К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка добавляют 5 капель ледяной уксусной кислоты, которая всегда содержит небольшое количество глиоксиловой кислоты. Полученную смесь вначале нагревают 1-2 мин на водяной бане, затем охлаждают и по стенке пробирки осторожно, по каплям, чтобы жидкости не смешивались, добавляют 10 капель концентрированной серной кислоты. Помещают пробирку в кипящую водяную баню. Наблюдают образование красно-фиолетового кольца на границе раздела двух слоев.

1.4. Реакция Фоля на цистеин. Принцип: цистеин, содержащий сульфгидрильную группу (-SH), при нагревании подвергается гидролизу с образованием сульфида свинца Nа₂S. Ацетат свинца реагирует со щелочью с образованием плюмбита натрия:

(CH₃COO)₂Pb + 2NaOH → Pb(ONa)₂ + 2CH₃COOH
Сульфид натрия при взаимодействии с плюмбитом дает черный (или бурый) осадок сульфида свинца: Na₂S + Pb(ONa)₂ + 2Н₂О → PbS↓ + 4NaOH.

Практическое значение цветных реакций на белки и аминокислоты:

Ø Биуретовая реакция используется для качественного и количественного определения белка в биологических жидкостях.

Ø Нингидриновая реакция используется для качественного и количественного определения свободных аминокислот в биологических жидкостях.

Ø Цветные реакции на отдельные аминокислоты используются для изучения химического состава белков.

Источник