Чем обусловлены реакции осаждения белков

Реакции необратимого осаждения белков

При необратимом осаждении происходит глубокая денатурация и агрегация белка. Денатурированный белок не способен к восстановлению своих первоначальных физико-химических и биологических свойств. Необратимое осаждение вызывается высокой температурой, действием концентрированных минеральных и некоторых органических кислот, ионов тяжелых металлов, алкалоидных реагентов, детергентов, красителей.

Реактивы: водный раствор яичного белка (раствор готовят, как указано в лабораторной работе №1; концентрированные серная, соляная и азотная кислоты; 5 %-й раствор ацетата свинца; 2,5 %-й раствор нитрата серебра; 5 %-й раствор сульфата меди.

Задание 1. Осаждение белков минеральными кислотами.

Реакция находит применение для быстрого определения белка в биологических жидкостях, например, моче.

Ход работы

Данную работу необходимо выполнять в вытяжном шкафу, соблюдая особую осторожность!

Задание 2. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Белки осаждаются солями меди, свинца, ртути, цинка, серебра и других тяжелых металлов. Свойство белков связывать ионы тяжелых металлов используется в медицине при оказании первой помощи пострадавшим от отравления солями меди, свинца, ртути.

Ход работы

Оформление результатов

Оформите результаты проведенных исследований в виде таблицы.

Источник

Чем обусловлены реакции осаждения белков

Реакции осаждения белков

4. Реакции осаждения белков

Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора.

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

1) неразведенный яичный белок;

2) насыщенный раствор сульфата аммония;

5) дистиллированная вода;

6) сульфат аммония в порошке.

Необратимое осаждение белков.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

Осаждение при кипячении.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы;

Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом раствор мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю раствора NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается.

Осаждение концентрированными минеральными кислотами.

Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислоты выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота.

1) яичный белок,1% раствор;

2) концентрированная серная кислота;

3) концентрированная хлористоводородная кислота;

4) концентрированная азотная кислота.

Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной кислот. затем, наклонив пробирку под углом 45 градусов, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит.

Осаждение органическими кислотами.

Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой кислотой пользуются при определении белка в моче.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор;

3) сульфосалициловая кислота, 10% раствор.

Осаждение белка солями тяжелых металлов.

Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

1) яичный белок, 1% раствор;

2) сульфат меди, 10% раствор;

3) ацетат свинца, 5% раствор;

4) нитрат серебра, 5% раствор.

Источник

Как удалить белки из раствора?

Денатурация

Денатурация – необратимое осаждение белка из-за разрыва связей, стабилизирующих четвертичную, третичную, вторичную структуры белка, сопровождаемое изменением растворимости, вязкости, химической активности, снижением или полной потерей биологической функции.

1. Физическая денатурация

Вызывается повышением температуры, ультрафиолетовым и микроволновым излучением, механическими воздействиями, ионизацией заряженными частицами.

2. Химическая денатурация

Зависит от природы денатурирующего реагента:

На эффекте химической денатурации основаны устаревшие, но простые и наглядные тимоловая проба и проба Вельтмана, используемые ранее в клиникo-лабораторной диагностике для оценки состава белков крови.

Высаливание

Соли в низких концентрациях способны взаимодействовать с ионными группами белков, отвечающих за внутримолекулярные взаимодействия, приводить к их раскрытию и повышать растворимость.

Так как белки плазмы крови отличаются по размерам, заряду, строению, то можно подобрать такие количества соли, которые вызовут осаждение менее устойчивых белков, пока другие еще будут растворены.

Например, раньше в диагностических целях так определяли соотношение белковых фракций альбумины/глобулины в плазме крови. Альбумины, как более полярные молекулы, остаются в растворенном состоянии при 50% насыщении раствора нейтральными солями, в то время как глобулины в этих условиях уже осаждаются. В норме соотношение альбумины/глобулины в плазме крови равно 1,2-1,8.

Осаждение водоотнимающими средствами

При добавлении водоотнимающих средств (ацетон, этанол) происходит отнятие у белка гидратной оболочки, но не заряда. Растворимость несколько снижается, но денатурации не наступает. Например, в этом заключается антисептическое действие этанола.

Изменение рН

Мягкое изменение рН до изоэлектрической точки белка ведет к исчезновению заряда, одновременному уменьшению гидратной оболочки и, как следствие, снижению растворимости молекулы.

Источник

Осаждение белков

Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения безбелкового раствора.

Обратимое осаждение.

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства.

Пример

В изоэлектрической точке белки обладают наименьшей способностью связывать воду, поэтому их легче осаждать. Агрегация белковых молекул происходит и при их обезвоживании с помощью некоторых органических растворителей – например спиртом и ацетоном. Молекулы этих веществ, являясь более гидрофильными, чем молекулы белка, образуют собственные гидраты с водой, оттягивая воду от белка, лишая их водной оболочки способствуют агрегации белка.

Обезвоживание белков можно проводить путем добавления нейтральных растворов солей высокой концентрации. Этот процесс называютвысаливанием. Осаждающая способность соли зависит от размеров катиона и аниона, а так же от величины их заряда. Высаливающее действие объясняется тем, что при высокой концентрации ионов в растворе белка, они оттягивают на себя от молекул белка поляризованные молекулы воды и тем самым лишают белок гидратной оболочки, которая препятствует осаждению белка. Метод высаливания используется для разделения и получения в очищенном виде белков и ферментов. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором – глобулиновая фракция.

При добавлении растворов нейтральных солей (Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄ и др.) небольших концентраций, растворимость белков в воде возрастает. Растворению белков, как и других веществ, способствуют те факторы, которые уменьшают взаимодействие между молекулами растворяемого вещества. Нейтральные соли в малых концентрациях увеличивают степень диссоциации ионизированных групп белковых молекул и тем самым уменьшают белок-белковое взаимодействие. Известно, что степень диссоциации электролитов (в том числе белков) прямо пропорциональна диэлектрической постоянной растворителя, которая в свою очередь пропорциональна степени поляризации молекул растворителя, их дипольному моменту. Нейтральные соли в малых концентрациях еще больше увеличивают диэлектрическую постоянную воды. В результате вода усиливает диссоциацию растворенного вещества, в частности белка. Входя между заряженными группами и ориентируясь вокруг них, диполи воды препятствуют их взаимодействию.

Изоэлектрическое осаждение. Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспаратата и глутамата (отрицательный заряд) и остатками лизина, аргинина и гистидина (положительный заряд). По мере повышения рН различными способами заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке оказывается равен нулю. В результате белок лишается своей ионной атмосферы и его частицы слипаются, выпадая в осадок, что объясняется отсутствием электростатического отталкивания между молекулами белка и наименьшей способностью связывать воду. Различные белки осаждаются при различных условиях, таким образом их можно фракционировать.

Источник

РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ. ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ

1. Высаливание белков сульфатом аммония.

Важным фактором устойчивости белков в растворе является наличие около частиц белка гидратной оболочки. Если к раствору белка прибавить соль, например (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄, NaCl и др., то вследствие разрушения водных оболочек частицы белка обычно слипаются друг с другом, укрупняются и выпадают в осадок. Разные белки высаливаются при неодинаковых концентрациях одних и тех же солей. Глобулины, например, осаждаются в полунасыщенном растворе сернокислого аммония, тогда как альбумины — в насыщенном растворе этой соли. Высаливание белков является обратимой реакцией. Денатурации белков при этом не происходит.

Ход работы: Наливают в пробирку 1-1,5 мл раствора белка, добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Наблюдают выпадение белого хлопьевидного осадка глобулинов. Мутную жидкость фильтруют через сухой складчатый фильтр. К фильтрату добавляют при перемешивании избыток сульфата аммония в порошке до прекращения его растворения. Появляется муть или хлопья выпадающих в осадок альбуминов. К осадку добавляют 2-3 кратное по объему количество воды и убеждаются в способности осадка к растворению.

2. Осаждение белков спиртом.

Спирт дегидратирует белки, вследствие чего происходит их коагуляция, агрегация и осаждение. Реакция осаждения белков спиртом при непродолжительном контакте его с белком обратима.

Ход работы: В пробирку наливают около 2 мл раствора белка, добавляют несколько кристалликов NaCl и по каплям этиловый спирт до образования хлопьев. После оседания хлопьев белка, сливают жидкость над ними, к осадку приливают воду, наблюдая растворение белка.

3. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Соли тяжелых металлов, например СuSO₄, HgCl₂, (CH₃COOH)₂Pb др., осаждают белки из растворов необратимо, что связано с образованием белково-металлических нерастворимых в воде комплексных соединений. При этом белки денатурируют. Структуры белка (кроме первичной) полностью разрушаются. Такой белок теряет способность выполнения свойственной ему функции. Изменяются при этом и физико-химические его свойства, белок теряет свою растворимость. Процесс денатурации, как правило, необратим.

Ход работы: В пробирку наливают около 2 мл раствора белка и прибавляют медленно по каплям раствор соли тяжелого металла (1%-ного раствора сульфата меди или 5%-ного раствора ацетата свинца).

Наблюдают коагуляцию белка. Выпавшие хлопья от прибавления воды не растворяются.

4. Осаждение белков органическими кислотами.

Трихлоруксусная кислота является специфическим реактивом на белок. Она осаждает только белки и не осаждает продукты распада белка и аминокислоты, поэтому ею пользуются для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, сыворотки крови, молока). В этих условиях продукты распада белков остаются в растворе.

Ход работы: В пробирку наливают 2-3 мл раствора белка и добавляют несколько капель 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Наблюдают выпадение осадка белка.

5. Осаждение белков при нагревании.

При нагревании белки денатурируют. Денатурация сопровождается изменением структуры белковых молекул с нарушением соотношения гидрофильных и гидрофобных групп в сторону увеличения последних. Такое изменение структуры молекул приводит к потере нативных свойств белка, в том числе к потере его растворимости.

В пробирку наливают 3-5 мл раствора яичного белка, вставляют в нее термометр и раствор нагревают до образования хлопьев. Замечают, при какой температуре образовались хлопья. Проверяют реакцию на обратимость.

Белок не выпадает в осадок, если среда, в которой он растворен, будет сильнокислая или сильнощелочная. Белковая молекула будет нести определенный заряд — положительный в кислой среде и отрицательный — в щелочной среде. При этом устойчивость белка повышается в результате электростатических сил отталкивания, и белок не выпадает в осадок.

Ход работы: В четыре пробирки налить раствор белка. Во вторую добавить несколько капель разведенной уксусной кислоты, в третью — крепкой ледяной уксусной кислоты, в четвертую — несколько капель щелочи. Все четыре пробирки прокипятить. Отметить изменения.

Пробирку с крепкой уксусной кислотой осторожно нейтрализовать щелочью, отметив изменения.

Источник